Gal-3參與阿爾茨海默病的機制研究進展

萬琪，謝曄，王蓉，駱延，曾俊偉

半乳糖凝集素-3（Gal-3）是一種分子質量為29～35 ku的蛋白，屬于結合半乳糖苷類的凝集素家族，可由其糖識別結構域（CRD）介導，識別并結合含有β-半乳糖的部分多糖配體。在巨噬細胞分布的Gal-3可通過加劇炎癥反應和氧化應激，促進脂質沉積和粥樣斑塊形成，參與動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的進程，因此，Gal-3被認為是心血管疾病的危險標志物和治療靶點［1-2］。此外，Gal-3也表達于哺乳動物的小膠質細胞。小膠質細胞被認為是大腦中的巨噬細胞，是中樞神經系統抵御病原微生物或傷害性刺激入侵的第一道防線，可通過誘發炎癥反應并釋放神經活性物質間接影響神經元功能，參與腦損傷及神經退行性疾病的進程［3］。Gal-3在阿爾茨海默病（AD）病變中的作用近年來備受關注。研究發現，海馬小膠質細胞的Gal-3表達異常參與了AD患者病變腦區神經元丟失過程和以β淀粉樣蛋白（Aβ）為主的淀粉樣斑塊形成，導致患者認知功能減退［3］。本文就近年Gal-3在神經系統的表達、相關信號通路及其參與AD的分子機制研究進展進行綜述，為研發可靶向抑制Gal-3功能的藥物，保護神經功能和臨床治療AD提供參考。

1 Gal-3結構

Gal-3基因又稱可溶性半乳糖苷結合凝集素3（LGALS3）基因，位于染色體1p13及14q21-22［4］。Gal-3是由130個氨基酸組成的五聚體環狀結構的蛋白質［1］，含有3個重要結構域：（1）C-端具有一個CRD和一個發揮抗凋亡作用的天冬氨酸-色氨酸-甘氨酸-精氨酸序列［5］。該序列與B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）家族同源。CRD結構域由大約135個氨基酸殘基組成，對β-半乳糖苷的親和力較強［3］。（2）N-端含約120個氨基酸，內含一個絲氨酸磷酸化位點［6］。（3）在CRD和N-端之間有一個膠原α樣序列（CLS），包含約100個氨基酸，含甘氨酸-酪氨酸-脯氨酸串聯重復序列［6］；CLS的存在對于維持Gal-3五聚體形狀起重要作用［3］。基質金屬蛋白酶（MMP）-2/9可作用于CLS的丙氨酸62-酪氨酸63位點，將Gal-3切割為含有CRD結構域的22 ku片段和含有N末端結構域的9 ku片段［7］。常見的可結合至Gal-3啟動子區域并調控其表達的轉錄因子有特異性蛋白1（Sp1）、環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）、SIS誘導元件（SIE）、核因子（NF）-κB和堿性螺旋-環-螺旋蛋白（bHLH）［3］。

2 Gal-3在神經系統的表達

形態學試驗觀察到Gal-3表達于脊椎動物的神經系統。在外周神經系統，Gal-3表達在坐骨神經的雪旺細胞［8］、背根神經節（DRG）神經元［9］、視網膜色素上皮細胞［10］和視神經［11］。在中樞神經系統，Gal-3表達在脊髓、皮層、海馬、下丘腦、尾狀核、紋狀體、腦室下區、小腦及胼胝體。原位雜交及免疫熒光染色技術觀察到，在大腦皮層和下丘腦分布的Gal-3主要位于神經元；在脊髓、海馬、尾狀核、小腦以及胼胝體分布的Gal-3主要位于小膠質細胞。在星形細胞瘤病變組織中Gal-3表達較高，而少突膠質細胞瘤病變組織中Gal-3表達較低［12］。在PC12［13］、BV2小膠質細胞［14］，Gli4［15］、T98G和U251［16］膠質瘤細胞株也有Gal-3的表達。Gal-3可在游離核糖體合成，由于缺乏控制其在經典分泌途徑中移位和分泌的信號序列，因此Gal-3無法利用內質網/高爾基體分泌系統，可直接以囊泡和（或）外泌體途徑進行分泌。Gal-3能通過羧基端最后28個氨基酸靶向胞核從而在胞核與胞質之間穿梭［3］，Gal-3的P（S/T）AP序列（又稱為晚期結構域）可與內吞體分選轉運復合體的腫瘤易感基因101蛋白組分結合，使Gal-3進入內體（一種膜包裹的囊泡結構）進而轉運到細胞外基質中［17］。所以Gal-3在胞漿、胞膜和胞外均有表達。這些關于Gal-3在神經系統各部位、各細胞表達水平的形態學研究成果，對深入研究其參與神經系統病變機制具有重要意義。

3 Gal-3信號通路簡介

Gal-3分子結構中包含有CRD、抗死亡序列以及CLS，因此可結合多種分子，通過調節下游信號發揮作用。在骨髓間充質干細胞中，Gal-3可與Gal-3結合蛋白（Gal-3BP）結合，促進Ras/絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/細胞外信號調節激酶（ERK）1/2通路激活，導致炎性因子白細胞介素（IL）-6分泌［18］。Gal-3的CRD結構域相關的信號通路主要有：（1）與Toll樣受體（TLR）2/4的N-糖鏈結合，激活TLR/髓樣分化因子（MyD88）/NF-κB-p65信號通路［19］。（2）與髓系細胞觸發受體2（TREM2）胞外域的糖鏈以及銜接蛋白DNAX激活蛋白12（DAP12）結合形成復合體，隨之促進脾酪氨酸激酶（Syk）磷酸化，發揮下游效應［20］。（3）與α3β1整合素上甘露糖苷乙酰氨基葡萄糖轉移酶（MGAT）5修飾的復合物n-聚糖結合，促進整合素連接激酶磷酸化，參與細胞遷移［21］。（4）與表皮細胞生長因子或轉化生長因子-β受體結合促進胞內信號轉導［22］。（5）與JAG1（jagged1，一種Notch配體）結合，激活Notch通路，并與Notch1受體胞內結合域相互作用，促進其核轉位［23］。（6）與糖基化的細胞表面胰島素受體相互作用，使其酪氨酸磷酸化并抑制下游信號，引起胰島素抵抗［24］。（7）與骨塑型蛋白受體1α結合，隨后骨形態發生蛋白信號激活，促進下游Smad1/5/8的磷酸化和分化抑制因子3表達［25-26］。（8）與肌球蛋白-2A結合，增強NF-κB受體活化因子配體（RANKL）/NF-κB受體活化因子（RANK）的下游途徑，抑制成骨細胞分化［27］。Gal-3的羧基端既可與β-連環蛋白（β-catenin）的氨基端結合，使其無法降解；也可以通過磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸蘇氨酸激酶（Akt）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），導致胞內β-catenin入核，促進下游靶基因表達［28］。Gal-3的NWGR基序相關的通路主要有：（1）通過NWGR基序的甘氨酸殘基促進Akt、ERK和Bcl-2基因相關啟動子（Bad）磷酸化，參與維持線粒體穩定，阻止細胞色素C（CytC）釋放并抑制隨后的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9激活，發揮抗凋亡作用［29-31］。（2）與Bcl-2相互作用，激活K-Ras蛋白，參與維持線粒體的穩定，并通過抑制CytC等促凋亡因子釋放，發揮抑制凋亡作用［32］。

4 Gal-3參與AD病變的機制

AD是一種神經退行性疾病，起病隱匿，病程較長，主要特征是淀粉樣β斑塊和tau神經原纖維纏結［3］。60%～80%的AD發病風險都源于遺傳因素，現已確定40多個與之相關的遺傳風險基因位點，涉及體內再循環途徑、炎癥和膽固醇代謝等，此外小膠質細胞的激活介導了AD病變的發生發展［20］。近年研究表明，Gal-3表達于哺乳動物的大腦皮層和海馬中，是參與小膠質細胞活性調節及炎性因子生成的關鍵分子之一［3，7，20］。

4.1 Gal-3參與AD病變進展的臨床及動物研究

4.1.1 臨床研究AD患者由于病變腦區神經元丟失和Aβ沉積，出現進行性的記憶困難和認知功能障礙。有研究按照臨床癡呆評定量表（CDR）評分將AD患者分為輕（CDR=1）、中（CDR=2）和重度（CDR=3）3個階段。基因生物學分析顯示，Gal-3基因多態性 變 異 增 加 了AD發 病 風 險［20］，攜 帶rs46443、rs46523和rs10099773等變異LGALS3基因的70～85歲老年人血清C-反應蛋白（CRP）水平顯著升高，簡易精神狀態檢查（MMSE）評分顯示這些患者認知能力明顯下降，提示Gal-3和炎癥反應可能參與AD病變［33］。來自美國［34］、中國［35］和沙特阿拉伯［36］的臨床研究表明，60歲以上AD患者血清Gal-3水平高于同齡健康人群，Gal-3含量隨CDR評分的升高而上升［34-35］；患者腦脊液Gal-3水平也高于同齡健康人群，AD患者的MMSE評分與患者血清Gal-3水平呈負相關［36］。此外，在AD患者尸檢后觀察到大腦額葉和顳葉皮層的Gal-3表達顯著高于正常人，額葉分布的Gal-3與小型淀粉樣斑塊存在共表達現象，顳葉分布的Gal-3主要位于Aβ斑塊周圍的小膠質細胞［20，37］。這些研究表明Gal-3的異常表達參與了AD病變進展。

4.1.2 動物研究由于5xFAD轉基因小鼠腦組織中，淀粉樣前體蛋白（APP）和早老蛋白-1（PS1）過表達，可重現AD病變中Aβ淀粉樣斑塊的病理特征，常用于AD領域的研究。隨著月齡（6～18個月）增加，在5xFAD轉基因小鼠的大腦皮層、海馬和丘腦中Gal-3表達上調并定位于Aβ斑塊周圍的小膠質細胞；對Gal-3敲除的5xFAD轉基因小鼠進行水迷宮實驗，觀察到認知/空間記憶障礙明顯緩解，同時Aβ斑塊形成明顯減少［20］。在大鼠海馬CA1區注射Aβ之后，在離子鈣結合適配器分子1（Iba-1）陽性細胞和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）陽性細胞均觀察到Gal-3表達上調［38］。在這些AD動物模型上，病變腦區Aβ淀粉樣斑塊和Gal-3表達異常的現象同時存在，為Gal-3參與AD病變進展提供了初步證據。

4.2 Gal-3參與AD病變的分子機制

4.2.1 促進Aβ寡聚體形成Aβ寡聚體大量增多是加速AD病變的一個重要因素。在動物實驗中，Gal-3基因敲除小鼠的海馬CA1區注射Aβ后形成的Aβ寡聚體明顯減少；在離體實驗中，Gal-3與單體Aβ肽結合后熒光強度明顯增加，免疫共沉淀試驗證實Gal-3可以與內源性Aβ單體相結合［20］。在Gal-3過

表達小鼠CA1區注射Aβ后形成較多Aβ寡聚體，提示Gal-3的過表達促進了Aβ寡聚體形成［37］。Halim等［39］在AD患者腦脊液中檢測到Aβ1-19肽的酪氨酸-10位點O型糖基化增強，Gal-3可能與Aβ肽的糖基化位點結合，促進了Aβ寡聚體形成。

4.2.2 抑制Aβ的降解Gal-3的高表達可以抑制部分Aβ降解酶的表達（活性），導致Aβ降解速度減慢。在培養的BV2小膠質細胞中加入Aβ纖維后，BV2細胞的腦啡肽酶（NEP，降解細胞外的Aβ42）和胰島素降解酶（IDE，多位點降解Aβ）表達下降，導致Aβ的聚集；相反，經Gal-3抑制劑和敲除Gal-3處理后BV2細胞NEP和IDE表達升高，細胞內外Aβ得到充分降解，Aβ聚集減少［20］。同樣，Tao等［37］在Gal-3基因敲除的AD小鼠中發現其海馬分布的NEP和IDE表達明顯升高，Aβ的聚集減少，表明抑制Gal-3可發揮促Aβ降解效應，深入研究發現Gal-3表達下降可抑制整合素α3通路，間接促進黏著斑激酶（FAK）/環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）激活，CREB可結合到NEP基因啟動子位點促進其轉錄。H4-APPsw細胞在淀粉樣前體蛋白基因中引入雙重瑞典突變（K595N/M596L）后可導致Aβ40和Aβ42過表達，是常用的AD細胞模型。Seki等［40］在該細胞觀察到Gal-3BP可以通過降低淀粉蛋白前β-分解酶1的活性，導致淀粉樣前體蛋白的裂解減少，隨后Aβ分泌降低，但Gal-3BP是否能削弱Gal-3在AD中的致病作用尚不明確，因此，有關Gal-3-Gal-3BP軸與AD病變之間是否存在關聯，還需針對AD患者大腦或動物模型進行深入研究。

4.2.3 促進炎癥反應小膠質細胞誘發的炎癥反應能夠促進AD病變進展。STAT蛋白抑制劑1（PIAS1）被認為是一種具有抗炎效應的蛋白，在AD小鼠海馬中PIAS1表達下降，抗炎效應減弱，而海馬Gal-3表達上升往往提示較強的炎癥反應，可見海馬炎癥反應參與AD病變［37］。研究發現，在大鼠海馬CA1區注射Aβ后小膠質細胞表達Gal-3增多；同時，Aβ寡聚體作用于人單核細胞白血病細胞（THP-1）后，炎性因子IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）表達及釋放增加；而Gal-3的表達上升可被TLR5抑制劑阻斷，說明Gal-3的表達受到TLR5下游通路分子的調控［41］；Gal-3抑制劑預處理可以明顯抑制Aβ纖維刺激THP-1細胞［41］、人臍血源性間葉干細胞［42］以及Grn基因敲除的Raw巨噬細胞［43］后誘發的Gal-3、IL-12、IL-8、一氧化氮合酶、TNF-α的表達與釋放［41-43］。Boza-Serrano等［20］發現，在Gal-3抑制劑作用下，BV2小膠質細胞的NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體表達減少。在Gal-3敲除小鼠的皮層小膠質細胞，Aβ纖維誘導產生的IL-6、IL-8和TNF-α表達及釋放也明顯減少，可見Gal-3高表達促進了炎癥因子的生成［43］。對海馬組織進行高通量測序顯示，在5xFAD轉基因AD小鼠海馬TLR4和TREM2/DAP12通路激活，但Gal-3基因敲除的AD小鼠海馬這兩條通路激活明顯減弱。由于TLR4和TREM2、DAP12大多存在于在小膠質細胞，推測Gal-3導致小膠質細胞激活，誘發炎癥反應的機制為Gal-3分別與TLR4和TREM2的糖鏈結合后并激活下游通路［20］，而免疫共沉淀試驗也證實Gal-3可以與TLR4或TREM2結合［37］。

4.2.4 調節溶酶體功能溶酶體功能異常可導致Aβ降解發生障礙，提高溶酶體自噬則為一種降解患者腦內Aβ的治療策略。在5xFAD轉基因小鼠中，Gal-3和組織蛋白酶B（由溶酶體產生）表達上升且共定位于皮層小膠質細胞［43］；在5xFAD轉基因小鼠腦組織（不含小腦）的溶酶體富集分離物中也檢測到Gal-3含量增加［44］。Aβ42與人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y細胞，常用于AD細胞模型制備）共孵育之后，細胞溶酶體活性氧產生增加，免疫熒光雙標記觀察到Gal-3與Aβ42、溶酶體膜蛋白標志物溶酶體相關膜蛋白1（LAMP1）、巨噬唾液酸蛋白（CD68，一種溶酶體膜蛋白）以及溶酶體自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3β（LC-3B）表達共定位，提示活性氧生成促進溶酶體膜募集Gal-3［45］。在離體實驗中，外源性Gal-3處理皮層原代小膠質細胞后，Gal-3與組織蛋白酶B（CTSB），LAMP1、CD68、LC-3等多種溶酶體蛋白表達共定位，且Gal-3和CTSB表達同步上升，由此初步推測Gal-3可促進小膠質細胞溶酶體功能增強，這有助于吞噬攝取Aβ單體，但對Aβ纖維的攝取量減少的現象，機制尚不清楚［20］。另有研究報道，海馬GSK-3β活性增強可導致轉錄因子EB的134/138位絲氨酸位點磷酸化，進而抑制其核轉位，無法啟動后續的多種溶酶體膜蛋白和組織蛋白酶的轉錄［46］，但這種抑制效應在AD小鼠海馬注射Gal-3之后解除［42］。研究表明，Gal-3通過抑制GSK-3β的活性，導致轉錄因子EB核轉位，啟動后續多種溶酶體膜蛋白和組織蛋白酶的轉錄，溶酶體功能增強，一定程度上增強小膠質細胞吞噬能力，但小膠質細胞吞噬過多Aβ之后，溶酶體功能障礙，影響小膠質細胞對Aβ的進一步吞噬和清除［47］。

5 Gal-3抑制劑的研發現狀

臨床上一般在AD患者出現明顯的認知障礙時開始治療，但此時Aβ的聚集和淀粉樣斑塊已經形成。鑒于Gal-3在AD中的致病作用已經明確，采用Gal-3抑制劑對Aβ的產生進行適度抑制，有可能產生一定的治療效果。Gal-3的大多數下游生物學效應與CRD結構域有關，Gal-3的抑制劑主要著眼于CRD結構域進行研發。改性柑橘果膠（MCP，一種從柑橘類植物中提取的天然多糖）作為Gal-3抑制劑可減輕蛛網膜下腔出血小鼠的血腦屏障和腦損傷［48］。MCP還可以減弱高脂飲食/鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠的神經炎癥、氧化應激和認知障礙。在離體試驗中，MCP能明顯緩解高糖刺激導致的BV-2小膠質細胞的氧化應激和炎癥反應［49］。目前包括MCP在內的Gal-3抑制劑還停留在離體試驗階段，要應用于臨床患者，還需要進行更多的試驗以提供充足的證據支撐。

6 小結

綜上，分布在AD患者大腦皮層和海馬等病變腦區的Gal-3表達上升，可通過增加Aβ寡聚體形成、抑制Aβ降解、促進神經炎癥和影響溶酶體吞噬功能促進AD病變進展。患者血清和腦脊液Gal-3含量均隨AD病變進展同步上升。因此，Gal-3可能成為檢測AD病變程度的潛在生物學標志物，Gal-3抑制劑為AD的治療提供了希望。