艾灸對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型大鼠皮膚氧化應(yīng)激及血清IL-6的影響

王彩霞

寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004

皮膚衰老是一個(gè)復(fù)雜的生命現(xiàn)象，在皮膚老化過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列生物學(xué)改變，如皮膚及皮下組織成分減少和免疫系統(tǒng)改變。皮膚老化不僅引起皮膚功能減退有損于容顏，還可能影響到人的生理、心理，同時(shí)與許多皮膚病如脂溢性皮炎、日光性角化病、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生也有著病因?qū)W關(guān)系[1]。因此，預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為美容醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。目前臨床上常用的抗皮膚衰老藥物有：維生素C、E、輔酶Q等。此外，注射肉毒素、皮膚提緊術(shù)、激光治療、自體脂肪填充術(shù)等也作為對(duì)抗皮膚衰老的手段，但有一定的風(fēng)險(xiǎn)及副作用。

中醫(yī)保健抗衰老歷史悠久，早在兩千多年前的醫(yī)學(xué)著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有關(guān)于艾灸延緩衰老的詳細(xì)記載。現(xiàn)代研究[2]表明，艾灸可通過(guò)清除氧自由基、提高免疫功能、調(diào)整脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等途徑以達(dá)到延緩衰老的目的，其中以清除氧自由基，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激紊亂為首要。本研究通過(guò)觀察艾灸“足三里”“關(guān)元”穴對(duì)衰老模型大鼠皮膚組織中氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及血清白介素-6的影響，從而探討其抗衰老作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，雌性，體重(200±20)g，級(jí)別：SPF。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥品、試劑與儀器 艾條(北京國(guó)醫(yī)研醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；維生素E(北京綠健園科技有限公司)。D-半乳糖生化試劑(源葉生物)，SOD、MDA、IL-6測(cè)定試劑盒(均由Elabscience公司提供)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Elabscience公司)。ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE)，INFINITE E PLEX型酶標(biāo)儀(Tecan Austria GmbH公司)，H1650-W臺(tái)式微量高速離心機(jī)(湖南湘儀)，D1008E型渦旋儀(D1008E公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 40只受試動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組，每組10只：分別為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(維生素E組)和艾灸組，所有動(dòng)物在統(tǒng)一條件下標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2 動(dòng)物造模與艾灸干預(yù) 除正常組外，每日給予造模大鼠(模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、艾灸組)頸背部皮下注射10%D-半乳糖(1000 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)注射 6 周，造成亞急性衰老模型[3]。從注射的第22天開(kāi)始艾灸治療。每日給藥造模后將大鼠用固定器固定，參照余曙光等[4]編寫的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行定位取穴(關(guān)元位于臍下約25 mm處；足三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下方約5 mm處)，對(duì)足三里和關(guān)元穴施溫和灸(以大鼠無(wú)劇烈嘶吼、掙扎為度)，每穴灸5 min，施灸前將穴區(qū)部位的毛剪干凈，灸后局部皮膚潮紅，不起泡。除艾灸組外，其余各組每天同一時(shí)間相同固定5 min，不做艾灸治療，亦不讓其聞到艾煙味。正常組頸背部皮下注射同等劑量0.9%生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組頸背部涂抹維生素E軟膠囊。每日1次，共治療21 d。

1.3 標(biāo)本采集

1.3.1 血清標(biāo)本采集 治療結(jié)束1 h后，用10%水合氯醛(3.5 mL·kg-1)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，用心臟采血法采集大鼠血液，靜置30 min，用離心機(jī)(3000 r/min )離心10 min后分離血清，取血清分裝，并在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 皮膚組織采集 取材當(dāng)天取脫毛后的背部皮膚組織約0.5 g，經(jīng)預(yù)冷生理鹽水漂洗，并除去皮下脂肪和其他結(jié)締組織，濾紙拭干后稱重，取9 倍質(zhì)量的預(yù)冷生理鹽水制成10%組織勻漿。勻漿液以3500 r/min的速度離心20 min，取上清液。分別按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)皮膚組織SOD活性、MDA含量和血清IL-6水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

由表1可知艾灸對(duì)大鼠皮膚組織中SOD活性、MDA含量和血清IL-6水平的影響，與正常組比較，模型組大鼠皮膚組織SOD活性顯著降低，MDA含量明顯升高，血清IL-6水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，艾灸可增強(qiáng)大鼠皮膚SOD活性，降低MDA含量，降低血清IL-6水平(P<0.01)。

表1 艾灸對(duì)大鼠皮膚組織中SOD活性、MDA含量及血清IL-6水平的影響

3 討論

機(jī)體衰老是生命過(guò)程的必然規(guī)律，是一個(gè)全方位、多因素作用的復(fù)雜過(guò)程，常伴隨著結(jié)構(gòu)退行性變化和機(jī)能衰退[5]。皮膚位于機(jī)體最外層，是人體最大的器官，具有調(diào)節(jié)水分、阻止病原體入侵和防止電解質(zhì)流失等作用，其衰老程度直接反映機(jī)體的老化水平[6]。衰老的皮膚臨床表現(xiàn)為皮膚松弛變薄、彈性降低、干燥粗糙、出現(xiàn)色素沉著和產(chǎn)生皺紋等特征[7]。皮膚衰老一般由內(nèi)源性因素和外源性因素引起[8]，前者屬于自然老化，與年齡有關(guān)，受遺傳基因調(diào)控和氧化損傷作用影響，又稱為固有性老化；后者則大多與環(huán)境有關(guān)，與人類關(guān)系最為密切的就是紫外線輻射，即光老化[9-10]。據(jù)目前文獻(xiàn)[11]報(bào)道，皮膚衰老與氧自由基增多、免疫力減退、膠原降解增加、端粒酶活性降低和炎性浸潤(rùn)等有關(guān)。

D-半乳糖是機(jī)體正常營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但連續(xù)給動(dòng)物注射D-半乳糖，就會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度持續(xù)增高，細(xì)胞內(nèi)醛糖還原酶將其還原為不能正常代謝的半乳糖醇，而半乳糖醇一旦在體內(nèi)堆積就會(huì)使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，同時(shí)可引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能受損，代謝紊亂，致使機(jī)體多系統(tǒng)、多器官功能減退，最終導(dǎo)致衰老[12-13]。本實(shí)驗(yàn)采用了D-半乳糖所致的大鼠衰老模型，該模型造模時(shí)間短，成模率高，且模型穩(wěn)定，而且部分指標(biāo)接近于自然衰老，因此得到廣泛應(yīng)用。

自由基-氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)是在自由基學(xué)說(shuō)基礎(chǔ)上發(fā)展而成的，為諸多學(xué)說(shuō)的中心[14]。自由基產(chǎn)生過(guò)量，尤其是活性氧自由基(ROS)堆積，可與細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生作用，形成脂質(zhì)自由基，它對(duì)生物膜脂結(jié)構(gòu)的破壞性極強(qiáng)，使蛋白質(zhì)(酶)變性，導(dǎo)致機(jī)體氧化和抗氧化平衡體系遭到破壞，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成機(jī)體衰老[15]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)存在清除氧自由基的防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶及維生素A、C、E等抗氧化物質(zhì)。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體抗氧化酶活性下降，抗氧化物質(zhì)合成減少，導(dǎo)致清除氧自由基的能力下降，從而產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)。因此，MDA是衡量體內(nèi)自由基代謝的敏感指標(biāo)，間接反映機(jī)體衰老[16]。SOD 可通過(guò)酶的水解反應(yīng)清除氧自由基，其活力高低是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[17-18]。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起重要作用[19]。研究顯示，在多種不同種屬的動(dòng)物衰老過(guò)程中，血清IL-6水平升高。IL-6的增齡性升高可能是對(duì)一系列長(zhǎng)期慢性應(yīng)激如炎癥、氧化、免疫應(yīng)急等適應(yīng)性改變的結(jié)果。IL-6與IL-6受體結(jié)合后，可在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生多種生物學(xué)活性，比如影響細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞分化等[20]。因此，血清IL-6水平的高低可作為個(gè)體化衰老的良好指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中艾灸能顯著降低大鼠血清IL-6水平，提示艾灸能有效增強(qiáng)衰老大鼠的免疫功能，有助于促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。

“關(guān)元”和“足三里”是防病抗衰老的重要穴位，有“長(zhǎng)壽穴”和“保健穴”之稱。“關(guān)元”穴位于任脈，是足三陰經(jīng)與任脈的交會(huì)穴，聯(lián)系命門真陽(yáng)，是一身元?dú)庵冢瑸殛幹兄?yáng)穴，屬先天之本，具有培補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)益精血、調(diào)理沖任之功，艾灸關(guān)元穴可補(bǔ)攝下焦元?dú)猓套o(hù)機(jī)體元陰元陽(yáng)[21]。“足三里”是足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴，胃之下合穴，為回陽(yáng)九針穴之一，是土經(jīng)中的土穴，屬后天之本，具有健運(yùn)脾胃、培土化元、益氣養(yǎng)血之功，是治療諸虛百損的常用穴[22]。本實(shí)驗(yàn)選用艾灸關(guān)元穴和雙側(cè)足三里穴，兩穴配合共同起到調(diào)節(jié)陰陽(yáng)平衡的作用，使先天之本與后天之本有機(jī)結(jié)合，共奏培元固本、益氣活血、健脾補(bǔ)腎、益壽延年之功，從而達(dá)到保衛(wèi)正氣、防病抗衰的目的[23]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠皮膚中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，血清IL-6水平顯著升高。與模型組比較，艾灸組皮膚中MDA含量降低，SOD活性增強(qiáng)，表明艾灸可通過(guò)降低皮膚MDA含量，增強(qiáng)SOD活性，降低血清IL-6水平從而起到抗皮膚衰老的作用。

綜上，艾灸具有抗皮膚衰老作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)皮膚抗氧化能力，減少皮膚組織氧自由基含量，調(diào)節(jié)血清免疫因子水平有關(guān)。