鐵皮石斛葉的安全性毒理學評價試驗研究

盧禮平 王 歡 熊 玲 楊 桃 潘 婷 唐靖雯 潘 梅*

1.貴州威門藥業股份有限公司，貴州 貴陽 550018；2.四川大學華西公共衛生學院分析測試中心，四川 成都 610041

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖。其味甘，性微寒，歸胃、腎經。具有益胃生津、滋陰清熱功效，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨痿軟[1]。主要含有多糖類、生物堿類、芪類、黃酮類、茐酮類、苯丙素類、甾體類等成分，其中鐵皮石斛主要的特征成分為石斛多糖[2]。現代醫學[3]證明鐵皮石斛具有增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂等作用。鐵皮石斛葉為加工鐵皮石斛鮮條(楓斗)的副產品[4]，研究[5-6]發現，鐵皮石斛葉在化學成分種類上與莖相似，僅各成分含量不同。2018年國家衛計委將鐵皮石斛葉作為新食品原料終止審查，審查意見為“鑒于該產品具有地方傳統食用習慣，建議按照《食品安全法》第29條管理，終止審查”[7]，即鐵皮石斛葉可作為地方特色食品管理。本研究擬通過對鐵皮石斛葉進行急性經口毒性試驗、遺傳毒性試驗(細菌回復突變試驗、哺乳動物紅細胞微核試驗、體外哺乳細胞染色體畸變試驗)、90 d經口毒性試驗和大鼠致畸試驗，以評價鐵皮石斛葉毒性和安全性，旨在為貴州省食品安全地方標準“鐵皮石斛葉”的建立提供理論支撐。

1 材料與儀器

1.1 動物與細胞 SPF級SD大鼠(20只，雌雄各半)、SPF級健康性成熟的未交配SD雄鼠和雌鼠，均由成都達碩實驗動物有限公司提供；SPF級昆明種小鼠(50只)、SPF級離乳SD大鼠(108只)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供；鼠傷寒沙門氏菌TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102購于上海保錄生物科技有限公司；中國倉鼠肺(CHL)細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 藥物與試劑 鐵皮石斛葉(采自貴州省內鐵皮石斛主產區，詳見表1)；2,4,7-三硝基-9-芴酮(TNF，批號：218031298，AccuStandard)；輔酶II(批號：410F022，Solarbio)；疊氮化鈉(NaN3，批號：MKBS2540V，Sigma-Aldrich)；絲裂霉素C(MMC，批號：LBP4042V，Sigma)；2-氨基芴(2-AF，批號：STBF2332V，Sigma-Aldrich)；MTT溶液(批號：20181210，Solarbio)；秋水仙素(批號：09754，Sigma)；1,8-二羥基蒽醌(Dan，批號：WXBC6772V，Sigma Aldrich)；環磷酰胺(CP，批號：17101825，江蘇盛迪醫藥有限公司)；小牛血清(批號：20161021，浙江天杭生物科技股份有限公司)；MEM培養液(批號：8117272，gibco公司)；雙抗(批號：J170012，Hyclone)；甲醛、冰乙酸、2,4,6-三硝基酚、氫氧化鉀、甘油、水合氯醛、茜素紅等均為國產分析純。

表1 鐵皮石斛葉產地

1.3 儀器 LS-C0150 CO2培養箱(Thermo Fisher Scientific)；GHP-9270隔水式恒溫培養箱(上海飛越實驗儀器有限公司)；GHP-9270倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；1510酶標儀(Thermo Fisher Scientific)；AU480全自動生化分析儀(Beckman Coulter)；M-series全自動血液細胞分析儀(Medonic)；ACL7000血凝分析儀(美國實驗儀器公司)；H-500尿液分析儀(迪瑞)；YZ6H檢眼鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 急性經口毒性試驗 急性經口毒性試驗參考GB 15193.3-2014《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗》限量法[8]。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 細菌回復突變試驗(Ames試驗) 細菌回復突變試驗參考GB 15193.4-2014《食品安全國家標準 細菌回復突變試驗》平板摻入法[9]。

2.2.2 哺乳動物紅細胞微核試驗 哺乳動物紅細胞微核試驗參考GB 15193.5-2014《食品安全國家標準 哺乳動物紅細胞微核試驗》[10]。

2.2.3 體外哺乳細胞染色體畸變試驗 體外哺乳細胞染色體畸變試驗參考GB 15193.23-2014《食品安全國家標準 體外哺乳類細胞染色體畸變試驗》[11]。

2.3 90 d經口毒性試驗 大鼠90 d經口毒性試驗參考GB 15193.13-2015《食品安全國家標準 90天經口毒性試驗》[12]。

2.4 致畸試驗 大鼠致畸試驗參考GB 15193.14-2015《食品安全國家標準 致畸試驗》[13]。

2.5 實驗數據統計 研究數據均采用Excel錄入，利用SPSS 16.0軟件開展統計學分析。計量資料符合正態分布，方差齊者采用T檢驗，若方差不齊采用秩和檢驗。其中，遺傳毒性試驗結果中，染色體畸變率的比較使用卡方檢驗，微核率的比較使用泊松分布法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 急性經口毒性試驗 鐵皮石斛葉[劑量：10 g/(kg·bw)]經口染毒后，兩周內未見動物死亡，亦無明顯的中毒癥狀或不良反應，即樣品對雌、雄性SD大鼠的急性經口LD50>10 g/(kg·bw)，判屬實際無毒級別。詳見表2。

表2 鐵皮石斛葉對SD大鼠的急性經口毒性試驗結果

3.2 遺傳毒性試驗

3.2.1 細菌回復突變試驗(Ames試驗) 無論加與不加S9的試驗，自發對照組的每皿平均回變菌落數均在正常值范圍內，而陽性對照組誘發的每皿平均回變菌落數均為自發對照組2倍以上，呈明顯陽性反應。鐵皮石斛葉各劑量組和溶劑對照組的平均回變菌落數均未超過自發對照組的1倍，呈陰性反應，即樣品無誘導試驗菌株回復突變的作用。詳見表3和表4。

表3 鐵皮石斛葉細菌回復突變試驗結果(第一次) (個/皿，

表4 鐵皮石斛葉細菌回復突變試驗結果(第二次) (個/皿，

3.2.2 哺乳動物紅細胞微核試驗 受試物各劑量組PCE/200比值與陰性對照組的差異均在20%以內，經統計無顯著性差異(P>0.05)，表示鐵皮石斛葉對小鼠骨髓細胞增殖無不良影響。結果顯示：陽性對照組雌、雄動物的微核率均顯著高于陰性對照組(P<0.01)，受試物各組的微核率與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，表明鐵皮石斛葉在小鼠骨髓細胞微核試驗中為陰性結果。詳見表5。

表5 鐵皮石斛葉對小鼠骨髓細胞微核發生率的影響

3.2.3 體外哺乳細胞染色體畸變試驗 經計算受試物對CHL細胞的IC50在-S9條件下為1.03 mg/mL，在+S9條件下為1.44 mg/mL。試驗中加或不加S9時，陽性對照細胞染色體畸變率均顯著高于陰性對照(P<0.05)，且畸變率均>10%，呈明顯陽性反應。各劑量組細胞染色體畸變率與陰性對照比較無顯著性差異(P>0.05)，且畸變率均<5%，表明鐵皮石斛葉在本實驗條件下，未引起體外培養的CHL細胞染色體畸變。詳見表6。

表6 鐵皮石斛葉對CHL細胞染色體畸變率的影響

3.3 90 d經口毒性試驗 大鼠90 d經口毒性試驗期間，對照組和3個劑量組動物攝食、飲水、大小便正常，生長發育情況表現良好，試驗前后眼部檢查無異常，未觀察到明顯行為改變和中毒表現。大鼠體重、食物利用率、血液學、生化指標、尿液指標、臟器重量和臟體比等指標未見損害性影響；實驗動物大體檢查及組織學檢查均未見由受試物引起的損害性改變。鐵皮石斛葉實際攝入的最大未觀察到有害作用劑量雄鼠為8.37 g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的112倍)，雌鼠為8.73 g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的116倍)。

3.4 致畸試驗 鐵皮石斛葉經口灌胃后各劑量組孕鼠均未見異常行為和中毒表現，各劑量組胎鼠體重、身長和對照組比較, 其差異均無統計學意義(P>0.05)。各組胎鼠均有胸骨缺失，未見胎鼠外觀畸形、內臟畸形的發生，故認為鐵皮石斛葉在最高劑量為人體推薦攝入量50倍[3.75 g/(kg·bw)]時，對母體無毒性作用，對胎鼠無致畸作用。

4 討論

急性經口毒性試驗結果表明鐵皮石斛葉對SD大鼠急性經口LD50>10 g/kg·bw，判屬實際無毒級別；鐵皮石斛葉的三項遺傳毒性試驗(細菌回復突變試驗、哺乳動物紅細胞微核試驗和體外哺乳細胞染色體畸變試驗)結果均為陰性，無致突變作用；大鼠90 d經口毒性試驗提示在本試驗條件下，設計最高劑量為人體推薦攝入量的100倍，實際攝入最高劑量雄鼠為112倍，雌鼠為116倍，鐵皮石斛葉未引起大鼠的整體健康狀況、生理生化功能和器官組織形態學等各項重要指標的異常變化。鐵皮石斛葉實際攝入的最大未觀察到有害作用劑量雄鼠為8.37 g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的112倍)，雌鼠為8.73g/(kg·bw)(人體推薦攝入量的116倍)；大鼠致畸試驗證實最高劑量為人體推薦攝入量50倍[3.75 g/(kg·bw)]，鐵皮石斛葉對母體無毒性作用，對胎鼠無致畸作用。

隨著國家衛生健康委、國家市場監管總局聯合印發《關于對黨參等9種物質開展按照傳統既是食品又是中藥材的物質管理試點工作的通知》文件出臺，以及貴州省衛生健康委關于《食品安全地方標準 鐵皮石斛葉(干葉)》[14]發布實施，標志著鐵皮石斛葉、鐵皮石斛可在一定范圍內作為食品原料合法使用，今后，以鐵皮石斛葉、鐵皮石斛為原料的食品研發將迎來前所未有的機遇。