基于網絡藥理學的當歸四逆湯“當歸-桂枝”治療痛經的作用機制研究

程 邦 鄧曉童 肖杰文 呂麗芳 劉 偉 歐嵩鳳 蘇志恒

廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021

痛經(dysmenorrhea)是最常見的婦科癥狀之一，具體表現為行經前后或月經期所表現出來的下腹部疼痛、墜脹，還會伴有面色蒼白、腰酸、嘔吐或其他不適[1-2]。根據全國婦女月經生理常數協作組的調查研究顯示，我國女性的痛經發生率約為33%，青少年女性痛經的發病率為20%～90%，其中包括15%的人群伴有重度痛經[3]。針對痛經的治療，目前常用的方法為藥物療法以及補充藥物療法。其中，使用非甾體抗炎藥和口服避孕藥為治療痛經的藥物療法，主要通過抑制前列腺素類物質合成來達到鎮痛作用[4]。然而，以上藥物長期使用所帶來的副作用如胃腸道等不良反應[5-6]亦不容忽視。痛經的中醫辨證分型在臨床中主要包括氣滯血瘀型、寒凝血瘀型、濕熱瘀阻型、氣血虛弱型和腎氣虧損型。目前已將不通則痛、不榮則痛作為痛經的基本病機[7]。原發性痛經氣血虛弱證是臨床較為常見的證型之一，該類患者主要表現為經期或者經后小腹隱隱作痛，月經量少、顏色比較清晰，面色無華，神疲乏力，舌質淡，脈無力。在臨床上目前已將益氣養血止痛、溫經散寒、活血化瘀止痛作為該證型的基本治療原則，且療效穩定[8]。

當歸四逆湯為中醫方劑名，出自《傷寒論》，為溫里劑，具有溫經散寒，養血通脈之功效，在臨床上常用于痛經的治療與緩解[9]。其由當歸、桂枝、芍藥、細辛、通草、甘草、大棗七味中藥組成，其中桂枝作為君藥，有暖脾胃、通血脈、補元陽的作用[10]。當歸為臣藥，具有調經止痛、補血活血之功效[11]，在治療經閉痛經、月經不調等婦科疾病方面素有婦科“圣藥”的說法[12]，現代研究[13-15]表明其具有抗氧化、鎮痛和促進造血功能等藥理作用。當歸補血養血活血，桂枝溫中補虛，二者在臨床上常用于痛經的治療[16-17]，但目前對其治療痛經的物質基礎和作用機制尚未明確。

當歸四逆湯在臨床上已被用作治療痛經的常用中藥，但細辛作為其中一味臣藥，其成分中含有的馬兜鈴酸具有較強的毒性，在臨床使用中更有“細辛不過錢”的說法。因此，本研究以減毒增效，辨證論治為原則，對當歸四逆湯中“當歸-桂枝”藥對治療痛經的作用機制進行了研究。同時，作為從系統性、整體性角度來研究的中藥網絡藥理學新方法則與中藥辨證論治的原則不謀而合[18-19]。網絡藥理學是基于系統生物學，對生物系統的網絡分析而進行多靶點藥物分子設計的新學科。其具有系統性、整體性的特點，從宏觀水平探討“藥物-靶點-疾病”之間的復雜網絡關系，旨在提高新藥臨床試驗的成功率，進而節省藥物的研發費用的一門新技術，現已廣泛用于中藥作用靶點預測及作用機制闡述中[20-22]。本研究采用網絡藥理學方法分析和預測當歸四逆湯中“當歸-桂枝”藥對治療痛經的作用機制，旨在為揭示其治療痛經的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 當歸-桂枝藥對成分和潛在靶點的獲得與疾病靶點的獲取 通過中藥系統藥理學平臺(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索當歸和桂枝兩味中藥的化學成分，設置化合物類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30% 對當歸-桂枝藥對的主要化學成分進行篩選。通過Swisstarget Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫查找當歸-桂枝藥對化學成分的潛在靶點。通過Drug Bank數據庫(https://www.drugbank.ca/)查找獲得痛經(dysmenorrhea)的相關靶點。

1.2 成分作用靶點與疾病相關靶點共同靶點的獲取 通過Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將當歸-桂枝藥對的成分作用靶點與痛經的疾病相關靶點取交集篩選得到共同靶點并繪制韋恩圖。所篩選得到的共同靶點可認為是當歸-桂枝藥對治療痛經的相關作用靶點。

1.3 化合物-疾病靶點網絡和蛋白互作網絡的構建 通過Cytoscape 3.8.2軟件(https://cytoscape.org/)構建化合物-疾病靶點網絡關系圖，以探究當歸-桂枝藥對治療痛經的作用機制。為了闡述靶點蛋白在系統水平之間的相互作用，將“1.4”所述共同靶點基因上傳至在線STRING 10.0數據庫(https://string-db.org/)，選擇研究物種為Homo sapiens，設定打分值為中等置信度0.4，獲取蛋白相互作用信息。將蛋白質相互作用信息導入Cytoscape 3.8.2軟件以構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡圖。

1.4 基因和通路的富集分析 為了進一步闡明中藥成分靶點的相關蛋白在基因功能中的相互作用，本研究采用David v6.8數據庫(https://david.ncif crf.gov/summary.jsp)對當歸-桂枝藥對的潛在靶點進行基因本體(GO)功能富集分析。將當歸-桂枝藥對的潛在靶點基因上傳至數據庫，選擇形式為official gene symbol。本研究選擇GO中分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)3個板塊對相關基因進行功能分析。利用Excel軟件對GO功能富集分析中的GO條目繪制條形圖。對中藥成分相關靶點蛋白在信號通路層面進行映射，采用David v6.8 數據庫對當歸-桂枝藥對的潛在靶點進行KEGG通路富集分析，并利用 Cytoscape 3.8.2 軟件對KEGG通路富集分析中的信號通路構建靶點-通路網絡。所富集到的通路被認為是治療疾病相關的主要通路。

2 結果

2.1 當歸-桂枝藥對活性化合物的篩選 通過TCMSP數據庫平臺分析，從當歸-桂枝藥對兩個藥物中篩選得到9個化合物(詳見表1)。其中，有2個化合物來自當歸，7個來自桂枝。

表1 藥對活性化合物基本信息

2.2 當歸-桂枝藥對化合物靶點與疾病靶點的交集 通過Drug Bank數據庫，從243個痛經相關靶點中篩選出79個疾病相關靶點。將當歸-桂枝藥對的61個化合物靶點以及痛經相關的79個潛在靶點上傳至Venny 2.1.0取交集后得到6個共同靶點，其可視為當歸-桂枝藥對治療痛經可能的潛在靶點(圖1、表2)。

表2 藥對治療痛經的潛在靶點

圖1 藥對化合物靶點-疾病靶點韋恩圖

2.3 當歸-桂枝藥對化合物-疾病靶點相互作用網絡 當歸-桂枝藥對化合物-疾病靶點相互作用網絡(圖2)總共包括了13個節點(7個化合物節點和6個靶點節點)和20條邊，其描述了成分-疾病靶點之間的相互作用關系，其中左側節點表示中藥成分，右側節點表示疾病相關靶點，每條邊則表示中藥成分與疾病相關靶點之間的作用關系。網絡中節點的度值(Degree)代表和各節點相連的路線和條數。根據網絡拓撲學屬性篩選其度值較大靶點來進行分析，找到連接成分較多起到樞紐作用的節點，可能是當歸-桂枝藥對化合物中治療痛經的關鍵靶點[23]。網絡中各成分的平均靶點數為3，則各靶點平均與3個成分產生相互作用，根據節點的度值列出排名前3的關鍵靶點(表3)。從中藥成分的角度，度值最高的β-谷固醇(M358)能與9個靶點蛋白產生相互作用，因此這個成分可能是當歸-桂枝藥對治療痛經比較重要的成分。從靶點角度，度值排名前2位的是孕酮受體(PGR)和前列腺素內過氧化合物酶2(PTGS2)，分別能與4個和7個成分產生相互作用。

2.4 當歸-桂枝藥對疾病相關靶點PPI網絡的構建與分析 為了更好地闡述當歸-桂枝藥對治療痛經的作用機制，本研究基于蛋白質-蛋白質互作關系(PPI)構建當歸-桂枝藥對治療痛經的潛在靶點PPI網絡(如表4、圖3所示)。PPI網絡包含6個節點，14條邊，其中節點表示蛋白。其中，度值最高的前列腺素內過氧化合物酶2(PTGS2)可與8個蛋白產生相互作用。緊隨其后的雌激素受體(ESR1)和孕酮受體(PGR)則同樣分別能與6個蛋白相互作用。

表3 藥對化合物-疾病靶點網絡關鍵節點及拓撲信息

圖2 化合物-疾病靶點相互作用網絡圖

表4 藥對治療痛經PPI網絡關鍵節點及拓撲信息

圖3 藥對與疾相關靶點PPI網絡圖

2.5 GO功能富集分析 利用DAVID平臺，對當歸-桂枝藥對的6個潛在靶點進行GO功能富集分析，得到40個GO條目。根據錯誤發現率(false discovery rate，FDR)小于0.05 篩選出4個GO條目(如表5、圖4所示)。 其中，生物過程相關的條目有2個，主要涉及一氧化碳生物合成過程的正調控和對雌二醇的反應方面；分子功能相關的條目也有2個，主要涉酶結合和前列腺素-內過氧化物合酶活動方面；細胞組成相關的條目則無。

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID平臺，對當歸-桂枝藥對的6個潛在靶點進行了KEGG通路富集分析，得5條信號通路(如表6、圖5所示)，分別為脂肪細胞中脂肪分解的調節(regulation of lipolysis in adipocytes)、 花生四烯酸的代謝(arachidonic acid metabolism)、 利什曼病(leishmaniasis)、 雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)和血清素的神經突觸(serotonergic synapse)。這代表了當歸-桂枝藥對的有效成分可能通過作用于這些通路來達到治療痛經的目的。

表5 GO功能富集分析(FDR<0.05)

圖4 GO條目分布圖(FDR<0.05)

圖5 靶點-通路網絡圖

表6 KEGG通路富集分析

3 討論

文章以減毒增效，辨證論治為原則，基于網絡藥理學技術研究了當歸四逆湯中關鍵藥對當歸和桂枝兩味中藥的活性成分對痛經的作用機制。將當歸-桂枝藥對的61個化合物靶點以及痛經相關的79個潛在靶點取交集后，共得到6個共同靶點。通過構建當歸-桂枝藥對化合物-疾病靶點網絡，分析了中藥成分與疾病靶點之間的相互關系。

3.1 相關靶點和基因作用機制分析 靶點網絡中的關鍵化合物β-谷固醇(Beta-sitosterol)具有明顯的抗炎、抗氧化作用，其潛在的關鍵作用靶點PGR、PTGS1、PTGS2均參與痛經的激素調節相關通路[24-25]。由此推測，β-谷固醇可能在當歸-桂枝藥對中發揮治療痛經的關鍵作用。PTGS2作為前列腺素生物合成過程中的關鍵酶，可調控機體內前列腺素的水平[26]。Fatemeh H等[27]發現原發性痛經女性在經期時，其前列腺素含量明顯高于正常女性的經期。這是因為前列腺素的靶細胞是子宮平滑肌細胞，當前列腺素的合成增加時，可導致子宮收縮增強、子宮血流減少從而誘發疼痛[28]。PGR是介導孕酮(progesterone，P)發揮生理作用的受體，其表達與機體內孕酮的最終效應密切相關[29]。P可抑制前列腺素F2α( PGF2α)的產生，緩解子宮平滑肌痙攣，減緩痛經[30]。張紅梅[31]研究發現，當歸提取物可顯著升高P含量，通過調節P的體內平衡而緩解痛經。因此，可推斷當歸-桂枝藥對對痛經的治療作用可能與其調控PTGS2和PGR蛋白的表達密切相關。將當歸-桂枝藥對的相關作用靶點進行PPI網絡構建，對網絡分析后發現多個關鍵相關靶點，包括PTGS2、ESR1和PGR等。ESR1與雌激素結合后，可激活血清中的肥大細胞，釋放致痛物質從而導致痛經[32]。有研究報道，雌激素含量增加會間接促進PGF2α的合成和釋放，導致子宮收縮、血供不足引起痛經[33]。由此推斷當歸-桂枝藥對中的活性成分可能通過調控ESR1的表達從而達到治療痛經的效果。

3.2 通路富集分析 富集分析結果表明，當歸-桂枝藥對治療痛經的基因功能主要體現在一氧化碳生物合成過程的正調控、對雌二醇的反應、酶結合和前列腺素-內過氧化物合酶活動方面。在KEGG通路分析中，共篩選得到6條通路，包括脂肪細胞中脂肪分解的調節、花生四烯酸的代謝、利什曼病、雌激素信號通路和血清素的神經突觸等通路。在花生四烯酸代謝通路中，共同基因PTGS1和PTGS2均在花生四烯酸合成前列腺素類物質過程中扮演著關鍵性限速酶的異構酶的角色。在細胞因子和生長因子等的刺激下，PTGS2的正常轉錄水平會被迅速誘導上調，從而催化花生四烯酸產生多種前列腺素，進而導致疼痛及炎癥反應[34-35]。與此同時，雌激素信號通路可通過雌激素調節前列腺素的生成進而影響痛經的形成。孕激素可促進雌二醇轉化為無活性的雌酮，減少前列腺素的生成，降低子宮平滑肌收縮活性，從而緩解原發性經痛[36]。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對當歸四逆湯中的關鍵藥對當歸-桂枝多成分、多靶點、多途徑的復雜網狀關系進行梳理，對其治療痛經的作用機制進行了探討，為臨床上當歸四逆湯和當歸-桂枝藥對治療痛經的使用提供科學的理論依據。