金釵石斛生物堿的提取技術及臨床前藥理作用研究進展

張成宸 袁仁鋒

1.遵義醫科大學藥學院，基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563000；2.甕安袁慶禮中醫醫院，貴州 甕安 550400

從古至今石斛就是稀有的名貴中藥，最早在《山海經》中不叫石斛，而叫林蘭、禁生。起初人們發現這種植物大多生長在石頭上，形態下粗上細，形似古代的斛，故名為石斛。石斛屬(DendrobiumSw.)為蘭科草本植物，喜溫暖、潮濕，全世界約有一千五百多種，我國有近八十種。石斛屬植物的莖是中藥石斛的主要來源，《中國藥典》記載的藥用石斛有金釵石斛、鐵皮石斛、霍山石斛和鼓槌石斛等。

金釵石斛(Dendrobiumnobile)因莖兩頭細中間粗，色澤金黃，形如金釵而得名。金釵石斛性寒、氣微、味苦，主要活性成分之一是生物堿，有保護神經、調節血糖和血脂、抗腫瘤等作用[1]。石斛堿是金釵石斛的特征性成分，在金釵石斛生物堿中含量最高，常用于評價金釵石斛藥材的品質。鐵皮石斛味甘、微寒，富含石斛多糖、萜類和黃酮，但生物堿含量低，用于增強免疫力、調節消化系統和心血管系統等[2-3]。霍山石斛氣微、味淡，主要成分為多糖，能夠改善急性肝損傷[4]。鼓槌石斛氣微、味淡，毛蘭素含量高于其他石斛品種[5]。金釵石斛如圖1所示(圖片攝于貴州省赤水市金釵石斛GAP基地)。

圖1 金釵石斛實拍圖

目前常用氣相色譜法檢測金釵石斛生物堿的含量。近年來出現超聲輔助離子交換樹脂、超聲輔助聚離子液體等新工藝制備金釵石斛生物堿，提取率高且節能環保。近五年文獻報道金釵石斛生物堿有保護神經、肝臟、心肌，降血糖、抗白內障和抗腫瘤的臨床前藥理作用。金釵石斛在臨床上可用于改善代謝綜合征及治療慢性萎縮性胃炎。為了更好開發和利用金釵石斛，文章綜述了金釵石斛生物堿的含量測定、提取技術、化學結構及臨床前藥理作用、機制和金釵石斛的臨床應用。

1金釵石斛生物堿的含量測定、提取技術及化學結構

1.1 含量測定 《中國藥典》將氣相色譜法作為金釵石斛含量測定的標準方法。石斛堿是金釵石斛的質量標志物，在莖中含量最高，在花和葉中含量次之。遵義赤水地區所產金釵石斛的石斛堿含量高于中國藥典標準0.4%。使用氣相色譜法測定赤水金釵石斛的石斛堿含量為10.6 mg/g[6]。采用高效液相色譜-質譜聯用法測定赤水金釵石斛莖的石斛堿含量高于6.0 mg/g[7]。通過高效液相色譜法測定赤水金釵石斛的石斛堿含量為3.0～4.0 mg/g[8]。

圖2 金釵石斛倍半萜類生物堿的結構式及分子式示意圖

1.2 提取技術 已有專利報道采用酸性乙醇提取、酸水溶液浸泡提取、超臨界流體萃取等工藝制備金釵石斛總生物堿。近年來采用超聲輔助離子交換樹脂制備金釵石斛生物堿，金釵石斛粉末用70%乙醇超聲輔助熱回流提取，浸膏用弱陰離子交換瓊脂糖凝膠柱脫色除雜，然后用強陽離子交換瓊脂糖凝膠柱分離得到金釵石斛總生物堿，液相色譜法檢測總生物堿提取率為7%[9]。采用超聲輔助聚離子液體制備金釵石斛生物堿，將金釵石斛超微粉碎后，加入乙醇超聲提取，以咪唑類陽離子型離子液體單體聚合形成的聚離子液體為固相萃取吸附劑，用30%～50%乙醇洗脫后，收集90%乙醇洗脫液真空冷凍干燥得到金釵石斛總生物堿，氣相色譜法檢測總生物堿提取率為0.49%[10]。

1.3 化學結構 目前已從金釵石斛中分離鑒定出十多種picrotoxane型倍半萜生物堿化合物。根據生物堿的結構特點分為三類：①倍半萜與吡咯環部分組成四環體系，氮原子上烷基取代或季胺化，如化合物1～7；②具有噁唑啉環，如化合物8～12；③含氮五元雜環開裂，如化合物13[11]。生物堿的結構式及分子式如圖2所示。

2 金釵石斛生物堿的臨床前藥理作用

2.1 藥物代謝動力學特征 通過石斛堿與CYP450酶體外共孵育，結合UPLC-HR-ESI-Orbitrap-MS技術，采用底物消除法計算石斛堿在人肝微粒體的半衰期(t1/2)為31.44 min[12]。石斛堿在人肝微粒體中的Ⅰ相代謝產物為mubironine B、石斛胺堿、5-烯-石斛堿等，Ⅱ相代謝產物為N-葡萄糖醛酸石斛堿[13]。小鼠灌胃給予石斛堿(60 mg/kg)，發現石斛堿能透過血腦屏障，在腸和肝臟達到較高藥物濃度[14]。

2.2 藥效作用及機制 近年來文獻主要報道金釵石斛總生物堿的臨床前藥理作用及機制(詳見表1)，關于金釵石斛生物堿化合物的藥理作用研究還較少。

2.2.1 保護神經 金釵石斛總生物堿改善鏈脲佐菌素誘導散發型老年癡呆大鼠的空間學習記憶能力障礙，減輕海馬CA3區神經元損傷，激活腦內胰島素信號通路，抑制Tau蛋白高度磷酸化[15-16]。在谷氨酸誘導大鼠海馬神經元損傷模型中，金釵石斛總生物堿可以減輕海馬神經元損傷，增加神經元自噬體數量，提高LC3BⅡ/LC3BⅠ比值，促進p62降解[17]。金釵石斛總生物堿抑制Aβ1-42誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡，降低CaMKK2磷酸化，減少Caspase-3蛋白活化[18]。金釵石斛總生物堿減輕Aβ25-35誘導大鼠皮質神經元損傷，增加突觸相關PSD-95及SYP表達；改善Aβ25-35誘導大鼠海馬神經元損傷，促進神經元自噬體形成及自噬體-溶酶體融合，通過酸化溶酶體室而提高溶酶體組織蛋白酶活性，增加溶酶體途徑降解[19-20]。金釵石斛總生物堿提高Aβ25-35誘導小鼠的空間學習記憶能力，減輕小鼠皮層和海馬組織損傷，減少神經元凋亡，機制與其上調神經營養因子CNTF、GDNF、BDNF表達有關[21]。金釵石斛總生物堿改善APP/PS1轉基因小鼠的空間學習記憶能力，減輕海馬神經元損傷，減少Aβ1-40和Aβ1-42表達，降低自噬泡數量，提高自噬溶酶體清除率，增強Cat D蛋白水解活性，增加v-ATPase A1蛋白表達，促進溶酶體酸化[22]。

金釵石斛總生物堿改善SAMP8衰老小鼠空間認知功能障礙，減輕皮層和海馬組織損傷，降低Aβ1-42蛋白水平，減少Aβ生成，增加Aβ降解，上調LC3、Beclin1和Klotho表達，下調p62表達；抑制PERK信號通路，降低calpain 1、GSK-3β和CDK5活性，抑制Tau蛋白高度磷酸化[23-24]。

石斛堿減輕氧糖剝奪/再灌注所致小鼠海馬神經元HT22細胞損傷，其機制與抑制細胞焦亡相關蛋白Caspase-1表達有關[25]。

2.2.2 保護肝臟 金釵石斛總生物堿改善CCl4所致小鼠急性化學性肝損傷，減輕肝組織形態和超微結構損傷，減少肝細胞凋亡，降低肝功能相關ALT和AST水平，機制與其抗氧化應激以及抑制炎癥反應有關[26-28]。

在高脂飲食誘導脂肪肝小鼠模型中，金釵石斛總生物堿減輕肝臟脂肪變性，降低膽固醇和甘油三酯，減少游離膽汁酸LCA、DCA、CA和CDCA含量，增加牛磺酸結合膽汁酸TMCA、TCDCA、TUDCA和THDCA含量，上調Cyp27a1、Cyp3a11、Fxr和Shp基因表達[29]。

2.2.3 保護心肌 金釵石斛總生物堿改善缺血再灌注誘導的犬心肌損傷，降低心肌對游離脂肪酸FFA的攝取率，下調長鏈脂肪酰輔酶A(LCACoA)濃度，減少脂肪酸轉位酶FAT/CD36異常表達[30]。石斛堿抑制高鈉鹽所致大鼠心肌成纖維細胞增殖，機制與降低NF-κB p65磷酸化及趨化因子MCP-1表達有關[31]。

2.2.4 降血糖 金釵石斛總生物堿降低高糖高脂復合鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠的空腹血糖和胰島素，機制與改善胰島素抵抗，上調肝臟IRS-2、IGF-1和骨骼肌GLUT4表達有關[32-33]。

DNLA：金釵石斛生物堿；β-amyloid aggregates：β-淀粉樣蛋白聚集體；Neurofibrillary tangles：神經原纖維纏結；Autophagosome：自噬體；Lysosome：溶酶體；Autophagolysosome：自噬溶酶體。圖3 金釵石斛生物堿的神經保護作用機制示意圖

2.2.5 抗白內障 在D-半乳糖所致大鼠糖尿病性白內障模型中，金釵石斛總生物堿改善大鼠晶狀體混濁，降低晶狀體糖基化蛋白表達；金釵石斛總生物堿還可以抑制H2O2誘導人晶狀體上皮細胞凋亡，緩解晶狀體氧化損傷引發的白內障[34]。

2.2.6 抗癌 金釵石斛總生物堿通過線粒體途徑誘導人結腸癌HT-29細胞凋亡[35]。石斛堿與順鉑聯合使用抑制非小細胞肺癌，減輕順鉑所致裸鼠心臟毒性；石斛堿單用通過線粒體途徑誘導人肺癌A549細胞凋亡[36]。

表1 金釵石斛生物堿的臨床前藥理作用及機制

表1(續)

3 金釵石斛的臨床應用

金釵石斛是中藥石斛的主要來源之一。金釵石斛在臨床上作為中藥用于改善代謝綜合征及治療慢性萎縮性胃炎，關于金釵石斛倍半萜生物堿化合物的臨床研究目前少有文獻報道。

3.1 改善代謝綜合征 代謝綜合征是一種常見慢性疾病，以肥胖、血脂異常、高血糖和高血壓為臨床特征。動物實驗表明金釵石斛能夠降低血脂、血糖，且無明顯副作用。文獻報道在單臂、非隨機、開放、探索性臨床試驗中，將30例代謝綜合征患者分配到治療組，受試者每天服用12 g金釵石斛粉(每天兩次，每次6 g)，療程持續8周，隨訪4周。測定受試者的體重、體重指數BMI，空腹血糖、血脂總膽固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白膽固醇HDL-c、低密度脂蛋白膽固醇LDL-c、游離脂肪酸，記錄研究過程中的不良事件，評估金釵石斛粉的有效性和安全性[37]。

3.2 治療慢性萎縮性胃炎 慢性萎縮性胃炎是一種消化道疾病，以胃黏膜萎縮性病變為臨床特征。動物實驗表明金釵石斛促進胃酸分泌，改善胃腸道運動。文獻[38]報道在臨床試驗中，將100例慢性萎縮性胃炎患者隨機分配到對照組(50例，予膠體果膠鉍和阿莫西林)及治療組(50例，予石斛養胃湯聯合膠體果膠鉍和阿莫西林)。對照組每天服用膠體果膠鉍600 mg和阿莫西林1.5 g，療程為1個月；治療組在對照組基礎上每天加服石斛養胃湯(含石斛30 g)，療程持續1個月。與對照組相比治療組的臨床療效總有效率更高，慢性萎縮性胃炎癥狀明顯改善，消瘦、食欲不振、腹痛、貧血癥狀消失或減輕，血清C反應蛋白、IL-6、TNF-α、胃泌素-17、胃蛋白酶原PGⅠ及PGⅡ降低，不良反應發生率較低。

4 展望

金釵石斛是國際二類瀕危保護植物，于1987年10月列為國家瀕危保護物種。遵義赤水地區的地理環境、氣候、巖土等條件非常適合金釵石斛生長，此處種植的金釵石斛品質很好。金釵石斛的人工栽培技術趨近完善，已實現藥材規范化種植，并建成赤水金釵石斛GAP基地，充足的藥材供給利于金釵石斛的合理開發及深入研究。近年來以石斛堿為質量標志物的金釵石斛質量控制體系逐漸規范，促進了金釵石斛藥材生產的標準化。

酸性乙醇提取、酸水溶液浸泡提取、超臨界流體萃取等工藝可用于制備金釵石斛生物堿，超聲輔助離子交換樹脂、超聲輔助聚離子液體等新提取技術的出現提高了金釵石斛生物堿的產率，降低了生產成本。在現有提取技術基礎上改進方法，研發出提取率更高、成本更低、節能環保的制備工藝，將有利于金釵石斛生物堿的工業化生產。

目前從金釵石斛中分離鑒定的生物堿大多是picrotoxane型倍半萜類生物堿，關于金釵石斛總生物堿的藥理作用研究集中在保護神經、肝臟、心肌，降血糖，抗白內障和抗癌等方面。今后采用先進的色譜和波譜技術從金釵石斛中分離鑒定結構新穎的倍半萜生物堿化合物，使用體外細胞模型和體內動物模型研究倍半萜生物堿化合物的臨床前藥理作用及機制，發現倍半萜生物堿作用的新靶點和新機制，闡明結構-藥效關系，為藥物研發提供先導化合物。臨床上將金釵石斛作為中藥使用，但金釵石斛發揮治療作用的有效組分或成分尚不明確，因此開展更全面的臨床試驗來確證金釵石斛總生物堿或生物堿化合物的療效具有重要意義。

市場上已有金釵石斛膠囊、金釵石斛洋參膠囊和金釵石斛葛根西洋參膠囊等多種保健品，但金釵石斛倍半萜生物堿相關的保健品尚未見開發。保健品研發具有成本低、周期短的特點，未來可將金釵石斛倍半萜生物堿作為保健品進行深度開發以適應不同人群的需求。