維生素D3對紫杉醇誘發大鼠周圍神經病理性疼痛的影響

吳春嫻，高彬，王亮，張瑞，孫建良

腫瘤化療藥物誘導的周圍神經病理性疼痛是化療藥物最常見的不良反應之一，總體發生率可高達38%～87%。紫杉醇（PTX）等化療藥物誘發的周圍神經病變（CIPN）主要表現為手足疼痛、麻木或痛覺超敏等癥狀，嚴重影響患者生活質量和化療療程的完成[1]。目前臨床常用的治療藥物，如離子通道阻滯劑、抗炎藥、三環類抗抑郁藥和抗驚厥藥物，均不能達到臨床預期的治療目標，且常伴有嚴重的毒副作用。研究表明，維生素D在治療神經病理性疼痛中發揮良好作用，在已建立的多種大鼠CIPN模型中，如坐骨神經慢性壓迫性損傷（CCI）導致的神經性疼痛模型和糖尿病周圍神經性疼痛模型等，都證實補充維生素D可減輕大鼠神經病理性疼痛的超敏反應，這可能與維生素D抑制炎癥和氧化應激有關[2]。本研究擬探討維生素D3對PTX誘發的大鼠周圍神經病理性疼痛的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組健康SD雄性大鼠35只（維通利華實驗動物技術有限公司提供），6周齡，體質量200～220 g，于寧波大學實驗動物中心（SPF級）適應3～5 d；大鼠飼養環境：室溫20～25℃，濕度60%，自由攝食和飲水，光照與黑暗時間均為12 h。將大鼠按隨機數字表法分為5組（n=7）：對照組（Con組）、PTX溶劑組（PTX Vehicle組)、PTX組、PTX+維生素D3溶劑組（PTX+VitD3Vehicle組）和PTX+維生素D3組（PTX+VitD3組)。

1.2 主要試劑和儀器PTX（阿拉丁公司，批號：D2123072，規格：250mg/瓶）；聚氧乙烯蓖麻油（阿拉丁公司，批號：I1805053，規格：250g/瓶）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20210820，規格：500 ml/瓶）；維生素D3（阿拉丁公司，批號：J2112208，規格：1g/瓶）；Von Frey纖維絲（美國Danmicglobal公司，型號：Aesthesio）；多功能微型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：Centrifuge 5430R）；智能冷熱痛覺測試儀（法國BIOSEB公司，型號：BIO-CHP）；ELISA試劑盒（上海泛柯實業有限公司，批號：202111）。

1.3 實驗動物建模及給藥將PTX溶于PTX溶劑（聚氧乙烯蓖麻油∶無水乙醇=1∶1，6 mg/ml），再用0.9%氯化鈉注射液稀釋至2 mg/ml。PTX組、PTX+VitD3組和PTX+Vit D3Vehicle組大鼠隔日腹腔內注射PTX 2 mg/kg，共4次（1、3、5及7 d）達到累積劑量8 mg/kg，建立CIPN模型。Con組和PTX Vehicle組于相同時間點腹腔注射等容量的0.9%氯化鈉注射液和PTX溶劑（聚氧乙烯蓖麻油∶無水乙醇∶0.9%氯化鈉注射液=1∶1∶4，1 ml/kg）。將維生素D3溶于無水乙醇（1g/l=40 U/l），再用0.9%氯化鈉注射液稀釋25倍至1.6 U/l。PTX+VitD3組和PTX+VitD3Vehicle組從1、3…19 d隔日腹腔注射維生素D3（2 000 U/kg）和維生素D3溶劑（0.1%乙醇1.25ml/kg），共10次。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況實驗期間每天觀察大鼠的運動、進食、飲水量、排便、排尿及脫毛等情況，并記錄有無扭體、抽搐等異常行為。于給藥前（d0）和給藥后1、3…19、20 d隔天記錄大鼠的體質量。

1.4.2 行為學測定所有大鼠分別于d0和給藥后4、8、12、16及20 d，用Von Frey纖維細絲測定50%右足底機械縮足反應閾值（50%PWTs），用冷熱板測痛儀測定熱縮足潛伏期（TWL）。

1.4.3 50%PWTs測定將大鼠置于底部為金屬篩網（1 cm×1cm）的透明有機玻璃箱（22cm×22 cm×22cm）中，玻璃箱被架高于實驗臺面50 cm。金屬網上蓋以透明的有機玻璃罩，先讓大鼠適應環境20 min左右,待大鼠的梳理和探究活動基本消失后，從2.0 g力度開始按照“Up&Down”法刺激大鼠后足掌底中部（避開突起部位），纖維絲需彎曲至“C”或“S”型并維持6～8 s，觀察大鼠是否出現縮足反應并記錄[3]。大鼠在刺激時間內或在移開Von Frey纖維時立即出現快速的抬足或舔足反應，記為陽性反應“X”，而大鼠無反應或身體活動所引起的縮足反應記作陰性反應“O”。陰性反應時，予大一級力度纖維絲進行刺激，陽性反應時則改用小一級的纖維絲進行刺激，如此連續進行直至出現第1次陽性和陰性反應的騎跨，再連續測定4次，得到一串以“O”或“X”組合的序列，將該序列與最后一根纖維絲編號（xf）代入公式50%PWTs（g）=10（xf+k）/1 000計算，為各根纖維絲取對數后的均差，約等于0.224。若計算得出的50%PWTs＞15.0 g或＜2.0 g，則仍以15.0 g或2.0 g作為最大或最小值，每次刺激之間間隔30 s。

1.4.4 熱縮足潛伏期（TWL）測定先讓大鼠適應環境20 min，待大鼠能較好的適應當前環境后,將大鼠放在表面溫度（52.0±0.1）℃的智能冷熱板測痛儀上，上面罩以透明塑料籠，當大鼠出現快速縮足、舔趾或撕叫任一反應時即踩下熱板儀的踏板，記錄熱板儀顯示屏上的時間即為TWL[4]。為避免大鼠出現組織損傷，設定熱板自動切斷時間為15s。每只大鼠測定3次，每次間隔15min，取3次平均值為大鼠TWL值。

1.4.5 大鼠血清25（OH）D3測定采大鼠眼眶血，分離血清，按照酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒說明書進行操作，全自動生化分析儀檢測大鼠血清25-（OH）D3水平，每個實驗都包含了標準曲線，每個樣本檢測2次，取平均值。

1.5 統計方法數據采用Prism 9.0（Graphpad,La Jolla，CA）軟件分析，正態分布的計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況實驗期間5組大鼠均未出現脫毛、腹瀉及運動失常等情況，毛色光滑柔軟，活動情況自如，體質量均緩慢增長。5組大鼠體質量在d0及給藥后1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及20d時差異均無統計學意義（F≤13.21，均P＞0.05），見封二彩圖3。

2.2 50%PWTs變化比較5組大鼠在d0時50%PWTs差異無統計學意義（F=197.7，P＞0.05）。PTX組和PTX+VitD3組大鼠50%PWTs在4、8、12、16及20 d時明顯低于Con組（t≥6.18，均P＜0.05）。PTX+VitD3組大鼠50%PWTs在8、12、16及20 d時明顯高于PTX組（t≥2.32，均P＜0.05），見封二彩圖4。

2.3 TWL變化比較5組大鼠TWL在d0時差異無統計學意義（F=151.2，P＞0.05）。PTX組大鼠TWL在4、8、12、16及20 d時明顯低于Con組（t≥6.46，均P＜0.05）。而PTX+VitD3組大鼠TWL在12、16及20 d時明顯低于Con組（t≥5.33，均P＜0.05）。PTX+VitD3組大鼠TWL在4、8、12、16及20 d時明顯高于PTX組（t≥4.21，均P＜0.05），見封三彩圖1。

2.4 血清25-（OH）D3的變化 5組大鼠血清25-（OH）D3在d0時差異無統計學意義（F=22.97，P＞0.05）。PTX組大鼠血清25-（OH）D3在12及20 d時明顯低于Con組（t≥2.63，均P＜0.05）。PTX+VitD3組大鼠 在20 d時明顯高于Con組（t=5.13，均P＜0.05）。PTX+Vit D3組大鼠血清25-（OH）D3在12及20 d時明顯高于PTX組（t≥5.01，均P＜0.05），見封三彩圖2。

3 討論

本研究參照文獻介紹的方法[5]，隔日腹腔注射PTX 2 mg/kg，共4次，觀察到模型組大鼠50%PWTs和TWL值均有顯著降低，且最低值出現在給藥后1周左右，這與之前研究結果一致[5]，表明PTX誘發的CIPN模型大鼠制備成功。

多個臨床實驗證實，補充維生素D可緩解多種類型的慢性疼痛，如偏頭痛、腰背痛、癌痛和骨性疼痛等[6]。動物研究也有報道維生素D3對完全弗氏佐劑（CFA）導致的慢性膝關節炎疼痛模型大鼠有鎮痛作用[7]。本研究針對PTX誘導的大鼠CIPN模型，發現反復腹腔注射維生素D3后，干預組較模型組大鼠50%PWTs在8 d開始有顯著升高，TWL在4 d時出現顯著升高并持續至20 d，但較對照組仍有明顯降低，提示腹腔注射維生素D3能夠在一定程度上緩解PTX誘發的大鼠機械和熱痛敏。

基于已有證據，推測維生素D3改善大鼠痛覺過敏的可能機制有：（1）維生素D在星形膠質細胞信號途徑中起著重要作用，從而發揮了神經保護作用[8]。（2）維生素D作為一種神經活性類固醇，可以調節神經元的興奮性。在一定程度上，這種免疫調節作用可以減輕疼痛癥狀[2]。（3）維生素D的鎮痛作用更有可能是由于其抗炎作用，而不是抗傷害作用。維生素D似乎是通過減少促炎細胞因子的釋放和抑制T細胞反應來發揮其抗炎作用[8]。此外，維生素D還可以調節脊髓中的促氧化劑和抗氧化標志物[9]。

維生素D3在體內的主要活性形式為25-（OH）D3和1，25-（OH）2D3兩種，其中25-（OH）D3為主要循環形式，且25-（OH）D3半衰期較1，25-（OH）2D3長，可以在血中維持比較恒定的濃度，通常用它來評估體內的活性維生素D3狀態較為準確。本實驗結果表明，腹腔注射PTX后，模型組大鼠的血清25-（OH）D3出現持續下降趨勢，表現為維生素D不足。維生素D3干預組的大鼠血清25-（OH）D3水平未見明顯降低，且在20d時較對照組有顯著升高（但仍在正常范圍內），表明隔日腹腔注射維生素D3（2000U/kg）是安全可靠的。但干預組大鼠的痛敏閾值在實驗期間仍較對照組顯著降低，表明血清25-（OH）D3水平與大鼠痛覺過敏之間無明顯關系。

維生素D3價格便宜，不良反應相對較少，即使出現通常也是輕微的。在作者實驗中也沒有觀察到大鼠體質量減輕和異常表現等毒性反應的現象。以往的臨床研究表明，人體攝入過量的維生素D（每天超過50000U）導致高鈣血癥的很少，每天服用10000U的維生素D3持續5個月，也沒有發現毒性反應[7]。且絕大多數患者并沒有使用維生素D3的禁忌證，因此維生素D3可能是一種安全、簡單和潛在有益的治療神經病理性疼痛患者的藥物。雖然有一定程度的證據表明，補充維生素D對治療慢性疼痛是有效的，但由于缺乏足夠的隨機和安慰劑對照臨床研究，目前的證據還不能證明補充維生素D3是對慢性疼痛有效的獨立治療方法。

綜上所述，腹腔注射維生素D3能夠在一定程度上緩解PTX誘發的大鼠周圍神經病理性疼痛，為臨床化療痛的防治提供了新的探索方向。