miR-338-3p靶向MACC1調節MEK/ERK信號通路抑制非小細胞肺癌的增殖和EMT

宗振峰 唐國杰 國玉

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是一種難治性惡性肺癌，在全球范圍內被列為癌癥相關死亡的主要原因[1-2]。NSCLC的特征在于多階段進展、遠處轉移和高死亡率[3]。據統計，NSCLC晚期患者的五年生存率低于15%[4]。因此，迫切需要研究NSCLC 發生和發展的分子機制。MicroRNA(miRNA)是長度約為 18～25個核苷酸的小型內源性非編碼 RNA，其通過與靶標 mRNA 的 3′-非翻譯區 (3′-UTR) 結合，對人類基因表達調控發揮重要作用[5]。MiR-338-3p 是位于染色體17q25上的miRNA，已有研究表明其在NSCLC組織和細胞中低表達，過表達miR-338-3p可抑制NSCLC細胞的增殖、遷移與侵襲[6]。通過生物信息學預測發現，miR-338-3p與MACC1 3′-UTR存在結合位點，但miR-338-3p能否通過調控MACC1來影響NSCLC細胞的增殖和上皮間質轉化(EMT)尚不清楚。因此，本研究主要探究miR-338-3p對NSCLC細胞增殖和EMT的影響，并探討相關作用機制。

資料與方法

一、 組織和細胞系

收集2019年6月-2021年6月在本院胸外科接受手術治療的NSCLC患者的癌組織以及癌旁組織共52對，進行速凍，液氮保存。本研究中涉及人類受試者的所有程序均符合赫爾辛基宣言(2013年修訂)。所有患者均簽署了知情同意書，本研究獲得了本院倫理委員會審核批準(2019-00403)。

人正常支氣管上皮細胞系HBEpiC及人NSCLC細胞系(包括A549、H1975、H1299和H292)均購自中國科學院典型培養物保藏中心細胞庫。

二、主要試劑與儀器

miR-338-3p模擬物(miR-338-3p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、MACC1過表達質粒(pcDNA-MACC1)及其陰性對照(pcDNA)均購自百奧邁科生物技術有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自上海意杰生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉染試劑、E-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-ERK1/2、ERK1/2、β-actin兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自索萊寶生物科技有限公司；N-cadherin、Snail、Slug、p-MEK、MEK兔多克隆抗體均購自美國Abcam公司。

三、 細胞培養與轉染

將HBEpiC、A549、H1975、H1299、H292細胞置于補充有10% FBS的DMEM培養基中培養。利用LipofectamineTM2000轉染試劑對A549細胞進行轉染，分為：空白組(正常培養的A549細胞)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-338-3p mimics組(轉染miR-338-3p mimics)、pcDNA組(轉染pcDNA)、MACC1組(轉染pcDNA-MACC1)、miR-338-3p mimics+pcDNA組(共轉染miR-338-3p mimics和pcDNA)、miR-338-3p mimics+MACC1組(共轉染miR-338-3p mimics和pcDNA-MACC1)，于37℃、 5% CO2培養箱中進行轉染。

四、 qRT-PCR檢測NSCLC組織及細胞中miR-338-3p、MACC1 mRNA表達水平

使用TRIzol試劑從組織和細胞中提取總RNA，利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒對RNA 進行逆轉錄，通過SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行擴增反應，分別以U6、GAPDH為內參，通過2-ΔΔCt法來評估miR-338-3p、MACC1 mRNA的表達。引物為：U6正向：5′-GCACCTTAGGCTGAACA-3′，反向：5′ -AGCTTATGCCGAGCTCTTGT-3′；miR-338-3p正向：5′-TGAGGGCAAGATGACAAAGA-3′，反向：5′-GCCCTTGCACTTGATGGTAT-3′；GAPDH正向：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；MACC1正向：5′ -GATGAACTTGATGTGCATCA GTTACTTAG-3，反向：5′-GTCGTGTAGTAGGATCTGGTCAGAGTTATG-3′。

五、 CCK-8法檢測細胞增殖

將各組細胞以2×104個/孔的密度接種在96孔板中，分別在0、24、48h時向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，37℃孵育2h。用酶標儀檢測450 nm處的OD值。

六、 western blot檢測蛋白表達

使用RIPA裂解緩沖液提取細胞中的總蛋白。將等量的蛋白質經電泳、轉膜、封閉后，將膜與一抗MACC1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2、β-actin在4℃下孵育過夜，然后與二抗在室溫下孵育1h。加入ECL顯影，ImageJ 軟件用于分析蛋白條帶灰度值。

七、 雙熒光素酶報告基因實驗

構建MACC1的野生型(WT-MACC1)與突變型3′UTR區質粒(MUT-MACC1)。利用LipofectamineTM2000轉染試劑將WT-MACC1和MUT-MACC1分別與miR-NC或miR-338-3p mimics共轉染于A549細胞，48h后，檢測熒光素酶活性。

八、 統計分析

結 果

一、 miR-338-3p在NSCLC組織及NSCLC細胞系中的表達

miR-338-3p在NSCLC組織中的表達顯著低于癌旁組織(P<0.05)(見表1)；與HBEpiC細胞比較，A549、H1975、H1299、H292細胞中miR-338-3p表達顯著降低，且A549細胞中miR-338-3p表達最低，因此，選用A549細胞進行后續實驗(見表2)。

表1 miR-338-3p在NSCLC組織中的表達

表2 miR-338-3p在NSCLC細胞系中的表達

二、 各組細胞中miR-338-3p、MACC1 mRNA及蛋白表達比較

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組miR-338-3p表達升高，MACC1 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組miR-338-3p表達無顯著變化(P>0.05)，MACC1 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組miR-338-3p表達無顯著變化(P>0.05)，MACC1 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)(見圖1、表3)。

圖1 western blot檢測MACC1蛋白表達

三、 各組A549細胞增殖能力比較

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組OD450值(24、48h)降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組OD450值(24、48)升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組OD450值(24、48h)升高(P<0.05)(見表4)。

四、 各組A549細胞EMT比較

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組E-cadherin蛋白表達升高，Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組E-cadherin蛋白表達降低，Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組E-cadherin蛋白表達降低，Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達升高(P<0.05)(見圖2、表5)。

圖2 western blot檢測E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達

五、各組細胞對MEK/ERK通路相關蛋白表達的影響

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達升高(P<0.05)(見圖3、表6)。

圖3 western blot檢測p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達

表6 各組細胞MEK/ERK通路相關蛋白表達表達情況

六、 雙熒光素酶報告基因實驗

Targetscan網站預測miR-338-3p與MACC1的結合位點，見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，與miR-NC和WT-MACC1共轉染組比較，miR-338-3p mimifile:///C:/Users/Administrator/Desktop/%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%8A%A0%E5%B7%A5/LCFK202211/LCFK202211.ebook/images/bbb6d9770084729dc4e7c9e162003b92.jpgcs和WT-MACC1共轉染組熒光素酶活性降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-MACC1共轉染組比較，miR-338-3p mimics和MUT-MACC1共轉染組熒光素酶活性無顯著性變化(P<0.05)(見表7)。

表7 A549細胞中熒光素酶活性比較

圖4 Targetscan網站預測miR-338-3p與MACC1的結合位點

討 論

NSCLC是最常見的肺癌，盡管NSCLC的診斷和治療水平不斷提升，但死亡率仍然很高[7]。因此，探究NSCLC發生和發展的機制并確定其診斷和治療的基因靶標至關重要。眾所周知，miRNA參與多種生物學過程，包括細胞生長、遷移、凋亡等[8]。越來越多的研究表明，失調的miRNA 通過調節癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲或EMT，在癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用[9]。白如雪等[10]報道miR-338-3p在胃癌組織中低表達，其低表達與胃癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移相關；謝景臣等[11]發現過表達miR-338-3p能夠抑制A549細胞的增殖和侵襲；孫玉成等[12]表明抑制miR-338-3p表達可促進胃癌細胞的增殖、遷移與侵襲。本研究結果顯示，miR-338-3p在NSCLC組織和A549、H1975、H1299、H292細胞中低表達，且miR-338-3p在A549細胞中表達量最低，選擇miR-338-3p表達量最低的細胞進行過表達miR-338-3p才更具有研究意義，因此，選用A549細胞進行后續轉染實驗。EMT是腫瘤細胞發生遷移侵襲的有效方式之一，其主要表現為上皮細胞向間質細胞表型的轉變，同時伴隨著上皮表型標志蛋白E-cadherin表達的減少，以及間質表型標志蛋白Vimentin、N-cadherin、β-catenin等表達的增加[13]。EMT還受多種信號因子的調控，如Snail、Slug是E-cadherin的轉錄抑制因子，在EMT的發生發展中具有重要的作用[14]。本研究結果顯示，過表達miR-338-3p可明顯上調A549細胞中E-cadherin蛋白表達水平，下調Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達水平，提示過表達miR-338-3p可抑制A549細胞EMT。本研究還發現，過表達miR-338-3p可抑制A549細胞增殖，以上結果表明miR-338-3p可作為抑癌基因抑制NSCLC的增殖和EMT。

絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(mitogen extracellular signal regulated kinase，MEK)/細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)通路的激活與腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學行為密切相關[15]。據報道，miR-209通過下調MEK/ERK信號通路抑制膠質瘤U87細胞增殖[16]；曲美替尼通過抑制MEK/ERK信號通路抑制NSCLC細胞的增殖[17]；LncRNA HOTTIP通過激活MEK/ERK通路促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和EMT[18]。本研究結果顯示，過表達miR-338-3p可顯著抑制MEK/ERK通路關鍵蛋白MEK、ERK1/2的磷酸化水平，提示過表達miR-338-3p對NSCLC細胞增殖和EMT的抑制作用可能與MEK/ERK通路有關。

miRNA可以通過直接靶向mRNA來調節基因表達[19]。本研究通過生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因實驗，證實MACC1為miR-338-3p的靶基因。MACC1是癌癥發展的關鍵調節因子，已有研究表明MACC1在NSCLC細胞中高表達，過表達MACC1可促進NSCLC細胞增殖、遷移與侵襲[20]；敲降結腸癌細胞HT-29的MACC1可上調E-cadherin表達，下調Vimentin表達，進而抑制EMT過程[21]。本研究結果顯示，過表達MACC1可顯著促進NSCLC細胞增殖、EMT以及p-MEK、p-ERK1/2的表達，而上調miR-338-3p表達可顯著抑制MACC1蛋白表達，推測過表達miR-338-3p可能靶向MACC1調節MEK/ERK信號通路抑制NSCLC細胞的增殖和EMT。為了驗證該推測，本研究設置了回復實驗，結果發現，上調A549細胞中MACC1的表達，顯著降低了miR-338-3p mimics對A549細胞增殖、EMT及p-MEK、p-ERK1/2表達的抑制作用，以上結果表明過表達miR-338-3p通過靶向抑制MACC1表達，阻斷MEK/ERK信號通路的激活，進而抑制NSCLC細胞的增殖和EMT。

綜上所述，過表達miR-338-3p通過靶向抑制MACC1表達，阻斷MEK/ERK信號通路的激活，進而抑制NSCLC細胞的增殖和EMT。miR-338-3p可能作為NSCLC治療的潛在分子標志物，為NSCLC的治療提供理論參考依據。