上尿路上皮癌腫瘤出芽與腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞及患者預(yù)后的相關(guān)性研究

李光影 楊靜

上尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）是一種非常罕見的惡性腫瘤，且男性發(fā)病率高于女性[1]。目前對(duì)于治療上尿路上皮癌的方法是腎輸尿管切除、膀胱袖狀切除加淋巴結(jié)清掃、術(shù)后膀胱灌注，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。目前上尿路上皮癌評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)為脈管癌栓、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等常規(guī)指標(biāo)，這已不能滿足臨床醫(yī)生對(duì)患者預(yù)后的評(píng)估，患者術(shù)后復(fù)發(fā)率及死亡率仍然較高，上尿路上皮癌需要更多可以提供早期診斷和評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)，因此探索上尿路上皮癌預(yù)后的特異性指標(biāo)尤為重要[2]。

腫瘤出芽（tumor budding，TB）是指存在于惡性腫瘤的浸潤邊緣，散在的獨(dú)個(gè)腫瘤細(xì)胞或≤4 個(gè)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群。腫瘤出芽具有上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，它在惡性腫瘤早期的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著不可或缺的作用[3-4]。研究顯示，腫瘤出芽還與結(jié)直腸癌、胃腺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌等不良預(yù)后相關(guān)[5-10]。但是，腫瘤出芽在上尿路上皮癌中的研究鮮少，腫瘤出芽與上尿路上皮癌主要臨床病理變化特征的關(guān)系，腫瘤出芽與上尿路上皮癌免疫微環(huán)境的關(guān)系，腫瘤出芽與上尿路上皮癌患者預(yù)后的關(guān)系都還未知。

在腫瘤微環(huán)境中，分布著一定數(shù)量的嗜中性粒細(xì)胞，它們?cè)谀[瘤微環(huán)境的維持及腫瘤進(jìn)展中扮演了重要的“角色”[11]。腫瘤微環(huán)境中的嗜中性粒細(xì)胞通過分泌各種酶類物質(zhì)、細(xì)胞因子及形成胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲，即腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（TANs）[12-13]。研究表明TANs 還與膀胱尿路上皮癌、結(jié)直腸癌等的進(jìn)展有關(guān)[14-17]。但TANs 與上尿路上皮癌患者預(yù)后的關(guān)系，腫瘤出芽與TANs 之間的關(guān)系還不明確。本研究通過探討腫瘤出芽與上尿路上皮癌主要臨床病理特征，腫瘤出芽和TANs 之間的關(guān)系，腫瘤出芽和TANs 與上尿路上皮癌患者預(yù)后的關(guān)系，以期為評(píng)估上尿路上皮癌患者的預(yù)后提供可靠的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016 年1 月-2020 年4 月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院85 例手術(shù)切除上尿路上皮癌患者的臨床資料，包括患者性別、年齡、腫瘤部位、pT 分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、脈管癌栓及神經(jīng)侵犯等。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)病理診斷為上尿路上皮癌；（2）所有患者術(shù)前均未接受放療或化療；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并膀胱癌；（2）既往有膀胱癌病史；（3）既往有其他腫瘤史；（4）術(shù)后30 d 內(nèi)死亡。男51 例，女34 例；年齡45～89 歲，中位年齡為67 歲。所有患者術(shù)后均經(jīng)電話的方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后第1 天開始隨訪，2 年內(nèi)每3 個(gè)月隨訪1 次，2 年后每6 個(gè)月隨訪1 次，中位隨訪時(shí)間為23 個(gè)月（2～54 個(gè)月）。以患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡或隨訪截止日期2020 年10 月為截止點(diǎn)，在隨訪過程中失訪或腫瘤未進(jìn)展患者作為終點(diǎn)數(shù)據(jù)處理。本研究通過電話的方式獲得了所有患者的知情同意，并得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤出芽的判讀 腫瘤出芽的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參照2020 版結(jié)直腸癌診療指南中腫瘤出芽共識(shí)，定義為200 倍鏡下存在于惡性腫瘤的浸潤邊緣，散在的獨(dú)個(gè)腫瘤細(xì)胞或≤4 個(gè)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0～4 個(gè)腫瘤出芽為低級(jí)別、5～9 個(gè)腫瘤出芽為中級(jí)別、≥10 個(gè)腫瘤出芽為高級(jí)別[18]。在高倍鏡視野（HPF）（×200）下，選取視野中最多數(shù)量的腫瘤出芽為最終數(shù)量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 使用購于Abcam 公司用于標(biāo)記TANs 的CD66b 抗體，通過全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)染色經(jīng)福爾馬林固定常規(guī)石蠟包埋4 μm 切片制成的85 例患者的病理切片，被抗體標(biāo)記的TANs 其主要著色于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈黃褐色。由兩名病理科醫(yī)生經(jīng)免疫組化染色聯(lián)合HE切片觀察TANs 數(shù)量，TANs 分為上皮TANs 和間質(zhì)TANs，但是筆者發(fā)現(xiàn)上皮中的TANs 數(shù)量和腫瘤中心間質(zhì)中的TANs 數(shù)量太少，所以筆者在400 倍鏡下觀察腫瘤浸潤前沿間質(zhì)TANs 數(shù)量，選取TANs最多的三個(gè)視野，求其平均值。浸潤前沿（invasive tumor front，ITF）定義為腫瘤與正常組織或器官的交界區(qū)域，在腫瘤浸潤邊緣和鄰近的非腫瘤性纖維脂肪基質(zhì)之間的寬度約為1 mm[19]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 進(jìn)行處理分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析腫瘤出芽水平與上尿路上皮癌臨床病理特征的關(guān)系。采用Spearman 法探索TANs與腫瘤出芽的關(guān)系。Kaplan-Meier 進(jìn)行生存分析，采用log-rank 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上尿路上皮癌組織中腫瘤出芽及浸潤前沿間質(zhì)TANs 浸潤情況 根據(jù)出芽共識(shí)，將85 例患者分為低-中級(jí)別出芽組和高級(jí)別出芽組。其中低-中級(jí)別出芽組72 例，高級(jí)別出芽組13 例。

在上尿路上皮癌浸潤前沿間質(zhì)中400 倍鏡下觀察到TANs 最多的三個(gè)視野并求其平均值，作為該病例TANs 的最終值，將所有病例的最終TANs數(shù)再平均，將平均值作為臨界值（平均值為16），≤16 為低TANs 組，＞16 為高TANs 組。上尿路上皮癌85 例患者，50 例為低TANs 組，35 例為高TANs 組。見圖1。

圖1 鏡下腫瘤出芽和TANs

2.2 上尿路上皮癌腫瘤出芽情況與上尿路上皮癌臨床病理特征的相關(guān)性 通過對(duì)腫瘤出芽情況與上尿路上皮癌患者臨床病理特征的研究發(fā)現(xiàn)，低-中級(jí)別出芽組和高級(jí)別出芽組患者的性別、pT 分期、腫瘤轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及神經(jīng)侵犯情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低-中級(jí)別出芽組和高級(jí)別出芽組患者的年齡、腫瘤部位、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小及復(fù)發(fā)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同腫瘤出芽級(jí)別與上尿路上皮癌患者臨床病理的比較[例（%）]

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

進(jìn)一步使用Spearman 法研究腫瘤出芽情況與TANs 水平之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽情況與TANs的水平呈正相關(guān)（rs=0.215，P=0.048）。見表2。

表2 腫瘤出芽與TANs之間的關(guān)系（例）

2.3 上尿路上皮癌腫瘤出芽水平與患者預(yù)后的關(guān)系 經(jīng)隨訪后，共有23 例患者死亡，其中低-中級(jí)別腫瘤出芽組中有16 例死亡，高級(jí)別腫瘤出芽組中有7 例死亡。進(jìn)行生存分析后發(fā)現(xiàn)，低-中級(jí)別出芽組總存活率為77.8%（56/72），高級(jí)別出芽組總存活率為46.2%（6/13）。兩組總存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.710，P=0.010），見圖2A。共有31 例患者疾病進(jìn)展，低-中級(jí)別腫瘤出芽組中有22 例疾病進(jìn)展，高級(jí)別腫瘤出芽組中有9 例疾病進(jìn)展。進(jìn)行生存分析后發(fā)現(xiàn)，低-中級(jí)別出芽組無病生存率為69.4%（50/72），高級(jí)別出芽組為30.8%（4/13）。兩組無病生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.334，P=0.001），見圖2B。共有16 例患者因此病死亡，低-中級(jí)別腫瘤出芽組中有10 例因此病死亡，高級(jí)別腫瘤出芽組中有6 例因此病死亡。進(jìn)行生存分析后發(fā)現(xiàn)，低-中級(jí)別腫瘤出芽組患者腫瘤特異生存率為86.1%（62/72），高級(jí)別腫瘤出芽組患者腫瘤特異生存率為53.8%（7/13）。兩組腫瘤特異生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.809，P=0.005），見圖2C。

圖2 Kaplan-Meier腫瘤出芽生存曲線圖

2.4 上尿路上皮癌TANs 水平與患者預(yù)后的關(guān)系 經(jīng)Kaplan-Meier 分析，低TANs 組36 例無疾病進(jìn)展，無病生存率為72.0%（36/50），高TANs 組患者無疾病進(jìn)展18 例，無病生存率為51.4%（18/35）。兩組無病生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.113，P=0.004）。低TANs 組和高TANs 組總存活率、癌癥特異生存率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 Kaplan-Meier腫瘤出芽生存曲線圖

3 討論

本研究通過評(píng)估腫瘤出芽與上尿路上皮癌患者主要臨床病理特征變化及預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于低-中級(jí)別出芽組，高級(jí)別出芽組患者多為男性、pT 分期較高、腫瘤容易轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及神經(jīng)侵犯常見，預(yù)后較差；高TANs 水平患者的無病生存率低。筆者進(jìn)一步研究了腫瘤出芽與腫瘤微環(huán)境中TANs 的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，腫瘤出芽情況與TANs 水平呈正相關(guān)，即腫瘤出芽數(shù)量越多的患者TANs 水平越高，提示腫瘤出芽與TANs 之間可能存在某種關(guān)聯(lián)，使之相互作用，進(jìn)而影響上尿路上皮癌患者的預(yù)后。

既往研究證實(shí)，腫瘤出芽與結(jié)直腸癌、胃腺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌等不良預(yù)后相關(guān)[5-10]。腫瘤出芽具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征，它在惡性腫瘤早期的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著不可或缺的作用。而惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移不是單一的過程，是通過多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、各種信號(hào)通路等協(xié)作完成的，而這種協(xié)作又與腫瘤微環(huán)境息息相關(guān)。

目前有關(guān)上尿路上皮癌中腫瘤出芽的研究很少，僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了腫瘤出芽與上尿路上皮癌臨床病理特征及與患者預(yù)后的關(guān)系。Kawamura 等[20]發(fā)現(xiàn)高腫瘤出芽與輔助化療狀態(tài)、高病理T 分期、淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位有關(guān)，多變量Cox 分析顯示淋巴侵犯和高腫瘤出芽是尿路上皮癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，高腫瘤出芽也是總生存率的獨(dú)立影響因素。本研究收集了85 例患者臨床資料及病理切片，發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽與男性、高pT 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、多脈管癌栓和多神經(jīng)浸潤有關(guān)，但與年齡、部位、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小及復(fù)發(fā)無關(guān)。

既往也鮮少有研究報(bào)道腫瘤出芽與上尿路上皮癌患者預(yù)后的關(guān)系，目前僅發(fā)現(xiàn)一篇，而其對(duì)腫瘤出芽的評(píng)估方法是在200 倍鏡下，選取視野下最密集的腫瘤出芽數(shù)量，若TB 數(shù)量≥10 個(gè)為高腫瘤出芽，反之則為低腫瘤出芽，用這樣的方法對(duì)腫瘤出芽與患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行評(píng)估[20]。本研究參照2020 版結(jié)直腸癌診療指南中腫瘤出芽共識(shí)，在顯微鏡下觀察HE 病理組織切片，根據(jù)出芽共識(shí)對(duì)腫瘤出芽進(jìn)行分級(jí)，分為低-中級(jí)別腫瘤出芽組和高級(jí)別腫瘤出芽組[18]。采用Kaplan-Meier 方法進(jìn)行單因素生存分析和log-rank 檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高級(jí)別腫瘤出芽上尿路上皮癌患者的預(yù)后較差，因此筆者推測(cè)腫瘤出芽可作為一個(gè)預(yù)測(cè)上尿路上皮癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。

筆者通過生存分析發(fā)現(xiàn)，上尿路上皮癌TANs作為腫瘤免疫微環(huán)境中的重要組成部分，與上尿路上皮癌患者預(yù)后相關(guān)，即較低的TANs 水平伴隨著患者較高的無病生存期。近年來，腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視。其中，間質(zhì)內(nèi)的TANs 是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分，是機(jī)體應(yīng)對(duì)腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)的重要機(jī)制，TANs的數(shù)量能夠在一定程度上反映機(jī)體對(duì)腫瘤的反應(yīng)程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)上尿路上皮癌浸潤前沿間質(zhì)中的TANs 水平與患者較低的無病生存率有關(guān)，而既往無有關(guān)TANs 水平與上尿路上皮癌患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，腫瘤出芽的水平與浸潤前沿間質(zhì)TANs 的數(shù)量呈正相關(guān)，即腫瘤出芽數(shù)量越多的患者，浸潤前沿間質(zhì)TANs 數(shù)量越多，預(yù)后較差；腫瘤出芽越低的患者，浸潤前沿間質(zhì)TANs 數(shù)量越低，預(yù)后較好。提示上尿路上皮癌腫瘤出芽與浸潤前沿間質(zhì)TANs 相互作用，從而調(diào)控上尿路上皮癌的發(fā)展，影響患者預(yù)后。然而腫瘤出芽與TANs 之間的相互作用機(jī)制還未明確。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤出芽的主要特征是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤出芽上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中可引起腫瘤微環(huán)境的某些變化，如會(huì)產(chǎn)生和提高一些促腫瘤因子水平，如轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長影響因子、表皮生長因子等；而腫瘤微環(huán)境中的少氧狀態(tài)、細(xì)胞因子、其他炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)等又影響著腫瘤出芽的產(chǎn)生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程[22-24]。而本研究發(fā)現(xiàn)在上尿路上皮癌中腫瘤出芽情況與微環(huán)境中的TANs 水平呈正相關(guān)，提示腫瘤出芽與TANs 之間可能通過某種信號(hào)通路、細(xì)胞因子聯(lián)系在一起，但具體的細(xì)節(jié)還需繼續(xù)深入探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)上尿路上皮癌腫瘤出芽情況與浸潤前沿間質(zhì)TANs 呈正相關(guān)，表明了腫瘤細(xì)胞出芽和TANs 與上尿路上皮癌臨床主要病理變化特征及預(yù)后的關(guān)系，為上尿路上皮癌診治研究提供了潛在的指標(biāo)。但腫瘤出芽與TANs 的判讀尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此，兩者是否能夠用于臨床還需更多的研究。