菌種固定化技術(shù)生產(chǎn)香芋普洱茶醋的研究

王 巖，蔣澤強(qiáng)，范海瓊，張小玉，袁新建，龍浩然

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 a.食品學(xué)院；b.江蘇省食品加工工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 淮安 223005)

香芋是熱帶潮濕地區(qū)普遍種植的經(jīng)濟(jì)作物，是多年生天南星草本植物地下卵形至橢圓形的塊莖，藥食兩用。香芋含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、脂類、維生素和鈣、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有多糖、酚類等物質(zhì)，具有健脾強(qiáng)胃、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用[1-2]。普洱茶是云南省特有名茶，含有多酚類物質(zhì)、游離氨基酸、咖啡因、茶多糖等成分，因其獨(dú)特的風(fēng)味及健康的特性備受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者和研究者的關(guān)注。普洱茶具有諸多保健功能，如降血糖、降血脂、抗衰老、抗過敏、預(yù)防癌癥等[3]。本研究嘗試把固定化發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于香芋普洱茶醋的釀造工藝中，為生產(chǎn)高品質(zhì)的香芋普洱茶醋提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮香芋(市售)；普洱熟茶(普爾思茅區(qū))；白砂糖(食品級(jí))；海藻酸鈉(分析純)；α-淀粉酶(100 000 IU/g)、α-1,4-葡萄糖水解酶(50 000 IU/g)：上海金穗生物科技有限公司；氯化鈣(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；安琪生香酵母、安琪葡萄酒用酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌(滬釀1.01)：上海迪發(fā)生物公司。

1.2 儀器設(shè)備

YXQ-30SII高壓滅菌鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海理達(dá)儀器廠；WH-YC-01恒溫水浴搖床：蘇州汶顥微流控技術(shù)股份有限公司；J-832小型打漿機(jī)：上海瑞派機(jī)械有限公司；XL-60C粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；WZ-111-113手持式折光儀：浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；PHS-3CW測(cè)定儀：北京九合儀器儀表有限公司；酒精計(jì)；酸堿滴定裝置。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)方法

糖度：手持糖度計(jì)法；酒精度：酒精計(jì)法；總酸度：酸堿中和滴定法；微生物指標(biāo)：GB 4789—2016。

1.4 菌種的固定化方法

取經(jīng)活化后的菌懸液與6.0%的海藻酸鈉溶液按照1∶1比例混合均勻，然后用注射器緩慢注入0.05 mol/L的氯化鈣溶液中造粒，再將固定化顆粒置于4 ℃條件下的氯化鈣溶液中保存24 h備用。

1.5 香芋普洱茶醋生產(chǎn)方法

1.5.1 香芋發(fā)酵前處理

香芋發(fā)酵前處理流程[4]見圖1。

香芋→挑選、清洗→去皮、切片→護(hù)色→制漿→液化(α-淀粉酶酶解)→滅酶→糖化(α-1,4-葡萄糖水解酶酶解)→冷卻

圖1 香芋發(fā)酵前處理流程

1.5.2 普洱茶發(fā)酵前處理

普洱茶發(fā)酵前處理流程[5]見圖2。

普洱茶→粉碎→浸提→冷卻→過濾

圖2 普洱茶發(fā)酵前處理流程

1.5.3 酒精發(fā)酵

酒精發(fā)酵流程見圖3。

糖化香芋料液和普洱茶浸提液(3∶1比例)混合→調(diào)整酸度和糖度→接種固定化釀酒酵母→酒精發(fā)酵→酒醪

圖3 酒精發(fā)酵流程

1.5.4 醋酸發(fā)酵

醋酸發(fā)酵流程見圖4。

酒醪→調(diào)整酒精度→接種固定化醋酸菌→醋酸發(fā)酵→過濾→澄清→精濾→殺菌→成品

圖4 醋酸發(fā)酵流程

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵階段接種固定化酵母菌的配比對(duì)酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調(diào)節(jié)料液起始pH值為4.5、酒精發(fā)酵糖度為16.0%；對(duì)料液進(jìn)行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母)，接種量為10%，控制發(fā)酵溫度為32 ℃；酒精發(fā)酵時(shí)每日檢測(cè)1次酒精含量，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次酒精含量，考察固定化釀酒酵母和生香酵母的比例對(duì)酒精產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。在酒精發(fā)酵階段，固定化酵母菌的菌種比例會(huì)對(duì)酒精產(chǎn)量產(chǎn)生影響，當(dāng)釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1時(shí)，酒精產(chǎn)量最高。

圖5 固定化酵母菌配比對(duì)酒精度的影響

2.2 酒精發(fā)酵階段的料液起始糖度對(duì)酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調(diào)節(jié)料液起始pH值為4.5，料液起始糖度分別為10.0%、12.0%、14.0%、16.0%和18.0%；對(duì)料液進(jìn)行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)，接種量為10%，控制發(fā)酵溫度為32 ℃；酒精發(fā)酵時(shí)每日檢測(cè)1次酒精含量，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次酒精含量，考察料液起始糖度對(duì)酒精產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。在酒精發(fā)酵階段，發(fā)酵料液的起始糖度會(huì)對(duì)酒精產(chǎn)量產(chǎn)生影響，酒精產(chǎn)量隨著糖度的增加而提高，待發(fā)酵6 d后，糖度為16.0%和18.0%時(shí)的酒精產(chǎn)量非常接近。綜合考慮原料及后期醋酸發(fā)酵階段，選擇酒精發(fā)酵起始糖度為16.0%。

圖6 起始糖度對(duì)酒精度的影響

2.3 酒精發(fā)酵階段固定化酵母菌的接種量對(duì)酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調(diào)節(jié)料液起始pH值為4.5、起始糖度為16.0%；對(duì)料液進(jìn)行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)，接種量依次為6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，控制發(fā)酵溫度為32 ℃；酒精發(fā)酵時(shí)每日檢測(cè)1次酒精含量，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次酒精含量，考察固定化酵母菌的接種量對(duì)酒精產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。在酒精發(fā)酵階段，酒精產(chǎn)量隨著固定化酵母菌接種量的增加而提高，發(fā)酵4 d后，酒精產(chǎn)量增加幅度呈減緩趨勢(shì)，繼續(xù)增加接種量，并未顯著提高酒精產(chǎn)量，而且還會(huì)加大固定化菌種制備的工作量。因此，選擇固定化酵母菌的適宜接種量為10.0%。

圖7 固定化酵母菌接種量對(duì)酒精度的影響

2.4 酒精發(fā)酵階段發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調(diào)節(jié)料液起始pH值為4.5、起始糖度為16.0%；對(duì)料液進(jìn)行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)，接種量為10.0%，酒精發(fā)酵階段發(fā)酵溫度依次為28、30、32、34、36 ℃；酒精發(fā)酵時(shí)每日檢測(cè)1次酒精含量，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次酒精含量，考察固定化酵母菌發(fā)酵溫度對(duì)酒精產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖8。在酒精發(fā)酵階段，發(fā)酵溫度低時(shí)發(fā)酵緩慢，發(fā)酵溫度高時(shí)發(fā)酵迅速，但是發(fā)酵溫度過高可能會(huì)造成酵母菌提前老化。因此，選擇發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖8 固定化酵母菌發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響

2.5 醋酸發(fā)酵階段的起始酒精度對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響

待酒精發(fā)酵結(jié)束，在酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行醋酸發(fā)酵。醋酸發(fā)酵階段的起始酒精度依次為6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，固定化醋酸菌接種量為10.0%，控制發(fā)酵溫度為34 ℃。醋酸發(fā)酵時(shí)每日檢測(cè)1次總酸度，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次總酸度，考察起始酒精度對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖9。在醋酸發(fā)酵階段，當(dāng)酒精度低于10.0%時(shí)，醋酸產(chǎn)量隨著起始酒精度的升高而逐漸提高；發(fā)酵4 d后，醋酸產(chǎn)量提高幅度呈減緩趨勢(shì)；當(dāng)酒精度高于10.0%時(shí)，因酒精度過高，醋酸發(fā)酵受到抑制，醋酸產(chǎn)量降低。因此，選擇起始酒精度為8.0%。

圖9 起始酒精度對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響

2.6 醋酸發(fā)酵階段固定化醋酸菌的接種量對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響

調(diào)節(jié)醋酸發(fā)酵階段的起始酒精度為8.0%，固定化醋酸菌接種量依次為6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，控制發(fā)酵溫度為34 ℃。醋酸發(fā)酵時(shí)每日檢測(cè)1次總酸度，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次總酸度，考察固定化醋酸菌的接種量對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖10。在醋酸發(fā)酵階段，固定化醋酸菌接種量對(duì)總酸度的影響較大，接種量低會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵緩慢，接種量高則產(chǎn)酸效率提高，但會(huì)因菌體細(xì)胞的過快生長(zhǎng)繁殖而消耗底物，從而影響醋酸產(chǎn)量。因此，選擇固定化醋酸菌的接種量為10.0%。

圖10 固定化醋酸菌接種量對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響

2.7 醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵溫度對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響

調(diào)節(jié)醋酸發(fā)酵階段的起始酒精度為8.0%，固定化醋酸菌接種量為10.0%，發(fā)酵溫度依次為28、30、32、34、36 ℃。醋酸發(fā)酵時(shí)每日檢測(cè)1次總酸度，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次總酸度，考察固定化醋酸菌發(fā)酵溫度對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖11。在醋酸發(fā)酵階段，發(fā)酵溫度低時(shí)發(fā)酵進(jìn)程緩慢，發(fā)酵溫度高時(shí)發(fā)酵進(jìn)程加快，但是發(fā)酵溫度過高可能會(huì)造成醋酸菌提前老化。因此，選擇發(fā)酵溫度為34 ℃。

圖11 固定化醋酸菌發(fā)酵溫度對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響

2.8 固定化菌種的發(fā)酵效果與非固定化菌種的發(fā)酵效果對(duì)比

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調(diào)節(jié)料液酒精發(fā)酵起始pH值為4.5、起始糖度為18.0%，對(duì)料液進(jìn)行滅菌處理后，分別接種已固定化的酵母菌和非固定化的酵母菌，接種量為10.0%，設(shè)置發(fā)酵溫度為32 ℃，開始酒精發(fā)酵。每日檢測(cè)1次酒精含量，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次酒精含量，考察固定化酵母菌和非固定化酵母菌的發(fā)酵效果。酒精發(fā)酵結(jié)束后，在酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行醋酸發(fā)酵，調(diào)節(jié)起始酒精度為8.0%、發(fā)酵溫度為34 ℃，分別接種固定化醋酸菌和非固定化醋酸菌，接種量為10.0%，開始醋酸發(fā)酵。每日檢測(cè)1次總酸度，連續(xù)發(fā)酵6 d，計(jì)6次總酸度，考察固定化醋酸菌和非固定化醋酸菌的發(fā)酵效果。固定化菌種與非固定化菌種的發(fā)酵效果對(duì)比見圖12。不論是酒精發(fā)酵階段，還是醋酸發(fā)酵階段，固定化菌種參與的發(fā)酵效果要優(yōu)于非固定化菌種參與的發(fā)酵，這主要是由于固定化發(fā)酵系統(tǒng)中的酵母菌或醋酸菌濃度很高，發(fā)酵過程中也會(huì)有游離態(tài)的酵母菌或醋酸菌不斷泄露，同凝膠內(nèi)的酵母菌或醋酸菌共同促進(jìn)產(chǎn)物的生成。

圖12 固定化菌種發(fā)酵與非固定化菌種發(fā)酵效果對(duì)比

2.9 香芋普洱茶醋的質(zhì)量指標(biāo)

2.9.1 產(chǎn)品感官指標(biāo)

色澤棕黃，均勻一致，醋香濃郁，具有香芋風(fēng)味，伴有茶香，無異味，適口性良好。

2.9.2 理化指標(biāo)

總酸(以醋酸計(jì))≥45.0 g/L；還原糖(以葡萄糖計(jì))≥10 g/L；氨基酸態(tài)氮≥0.9 g/L。

2.9.3 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤100 cfu/mL；大腸菌群≤2 cfu/mL；致病菌未檢出。

3 結(jié)論

以香芋和普洱茶為原料，采用菌種固定化技術(shù)生產(chǎn)香芋普洱茶醋。酒精發(fā)酵階段，起始糖度為16.0%，固定化酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)接種量為10.0%，發(fā)酵溫度為32 ℃；醋酸發(fā)酵階段，起始酒精度為8.0%，固定化醋酸菌接種量為10%，發(fā)酵溫度為34 ℃。菌種固定化發(fā)酵效果優(yōu)于菌種非固定化發(fā)酵，所得香芋普洱茶醋具有良好的質(zhì)量指標(biāo)。