基于轉錄組測序金絲草葉片響應鉛脅迫的抗氧化酶相關基因

朱晨璐，武欣怡，喻君保，黃偲祺，曹樹一，翟林，韓雪潔，侯曉龍，2，3*

（1.福建農林大學林學院，福州 350002；2.南方紅壤區水土保持國家林業和草原局重點實驗室，福州 350002；3.海峽兩岸紅壤區水土保持協同創新中心，福州 350002）

土壤重金屬污染是世界普遍關注的環境問題，土壤重金屬污染修復是目前研究的熱點[1]。植物修復克服了傳統物理和化學修復投資大、破壞土壤結構并且容易造成二次污染等缺點，是一項經濟、綠色、環保的修復技術，受到普遍青睞[2]。近年來，有關學者在重金屬超富集植物的篩選、植物效果和耐性機理方面開展了較多研究[3-5]，篩選出了一些針對不同重金屬的超富集植物，例如：砷（As）超富集植物蜈蚣草（Pteris VittaL.）[6]、2007年發現的鉻（Cr）超富集植物李氏禾（Leersia hexandraSw.）[7]、鎘（Cd）超富集植物東南景天（Sedum alfrediiHance）[8]等。但是，目前篩選出的超富集植物普遍具有生物量小、富集重金屬單一等問題，因此限制了植物修復技術的大范圍應用[5]。植物對重金屬的轉運、耐受及富集能力是植物修復技術的關鍵，尋找超富集植物并探討其對重金屬脅迫的響應機制，從而進一步提升植物修復效率，已受到學者們的廣泛關注[9]。研究表明一些超富集植物可通過形態的改變或生理的調控來適應重金屬脅迫，但目前對植物適應重金屬脅迫的內在機制尚不清晰，特別是在分子生物學機制方面還有待進一步深入探索。

金 絲 草[Pogonatherum crinitum（Thunb.）Kunth.]是一種重金屬鉛（Pb）的超富集植物，該植物能在Pb含量高達20 000 mg·kg-1的脅迫環境中正常生長，在重金屬礦區金絲草生物轉運系數可以達到10.18[10]。重金屬Pb脅迫下，金絲草可通過提高抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）]、提高滲透性調節物質含量[脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（Cpr）]和調控抗壞血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環等策略來適應Pb脅迫環境[11]，特別是隨Pb脅迫濃度的增大，金絲草體內抗氧化酶活性呈增加趨勢[12]，說明抗氧化系統在抵御重金屬毒害中起重要作用，但對其分子生物學過程尚不清楚。目前，國內外對植物響應逆境脅迫的抗氧化酶相關基因已開展一些研究。邵文靜等[13]的研究發現 高 粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]的SbSODs、Sb-PODs等基因在低溫脅迫下上調表達，這一發現為探討高粱耐低溫機制提供了參考；肖生鴻等[14]的研究發現低濃度的汞（Hg）會誘導POD3、CAT2等基因上調，以此來降低重金屬的毒害。研究表明芥菜[Brassica juncea（L.）Czern.]幼苗通過提高與CAT、POD和SOD等酶相關基因的表達量，加強抗氧化系統抗逆性，從而響應脅迫[15]；ALARAIDH等[16]的研究發現在Pb、Cr和Cd脅迫下，葫蘆巴（Trigonella foenum-graecumL.）通過調控CAT、POD等酶的相關基因不同程度地表達來減弱重金屬對其的毒害作用；通過對苜蓿（Medicago sativaL.）的研究發現，非生物脅迫環境可刺激抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和SOD等相關酶的表達使之適應脅迫環境[17]。但目前對金絲草耐Pb的分子機制尚未明確，對其響應Pb脅迫的抗氧化酶相關基因及其作用機制尚不清晰。

本研究以Pb超富集植物金絲草為研究對象，設計不同Pb濃度模擬脅迫試驗，比較不同Pb脅迫處理下金絲草抗氧化酶活性的差異，對Pb脅迫處理的金絲草葉片進行轉錄組測序，篩選出與抗氧化酶活性相關的差異表達基因并進行qRT-PCR驗證，揭示與金絲草響應Pb脅迫的抗氧化酶相關基因及其作用機理，為更深入揭示植物響應Pb脅迫的內在機理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的金絲草采用種子培養，種子采自福建三明鉛鋅礦區。將種子均勻撒到溫室中的苗床上，保持土壤含水量為田間持水量的70%左右，待金絲草長至15 cm左右時開展脅迫試驗。

1.2 試驗設計

選擇長勢一致的金絲草幼苗，清洗干凈根系后，移栽到盛有1/8 Hoagland營養液的水培裝置中，并使用定植籃、定植棉固定，每盆移栽幼苗15株，在營養液中緩苗3 d后開始Pb脅迫試驗。設置不同濃度Pb處理，分別為300、500、1 000 mg·L-1和2 000 mg·L-1（分別用Pb300、Pb500、Pb1000和Pb2000表示），采用（CH3COOH）2Pb配制的60 mg·L-1的Pb溶液，按照設計的Pb脅迫濃度加入相應Pb溶液于裝有營養液的培養裝置中，同時設置無Pb脅迫的對照試驗（CK）。營養液為1/8的Hoagland營養液，營養成分見表1，其中KH2PO4濃度由原配方的0.136 g·L-1減少為0.680 mg·L-1，以避免產生沉淀。用去離子水反復清洗金絲草根系后移入不同Pb濃度的脅迫液中，置于人工氣候培養箱中進行脅迫試驗，溫度為25℃，濕度為75%，光照強度為6 000 lx，晝夜光照時間為16 h/8 h，脅迫時間為7 d。選取新鮮金絲草葉片剪碎混勻裝入離心管，經液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。CK、Pb300、Pb500、Pb1000和Pb2000處理的樣品用于抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量測定、RNA提取，并供熒光定量使用，每個處理各3次重復。同時選取CK、Pb1000處理的樣品用于RNA測序分析，每組3次重復。

表1 Hoagland營養液組分Table 1 Components of Hoagland nutrient solution

1.3 試驗方法

1.3.1 抗氧化酶的測定

制備酶液：稱取金絲草新鮮葉片0.2 g，使用液氮在研缽中研磨成勻漿后放入4 mL離心管，加入1 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8的磷酸鹽緩沖液，定容至4 mL。利用渦旋儀混勻，放入冷凍高速離心機4℃、10 000 r·min-1下離心10 min，取上清液放入4℃冰箱備用。金絲草葉片SOD、CAT、POD活性和MDA含量分別采用氮藍四唑法、紫外吸收法、愈創木酚法和硫代巴比妥酸法測定[18]。

1.3.2 RNA提取、測序和組裝

新鮮植株使用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，利用超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度（濃度需大于50 ng·μL-1，OD值在1.8～2.0之間，保證RNA純度）。配制1%的瓊脂糖膠，將RNA樣品加入進樣口，電泳約20 min，將膠放置在全自動凝膠成像儀上觀察樣品的完整度及是否存在DNA污染跑膠。得到的RNA經質檢后建立文庫，使用Illumina HiSeq 4000測序平臺測序，將最終得到的clean reads利用組裝軟件Trinity[19]進行組裝并評估。用RSEM軟件對組裝出來的unigene定量。

1.3.3 差異基因分析

將基因表達水平中的reads count數據，使用DESeq2[20]軟件進行分析，得到差異基因。FDR（錯誤發現率）＜0.05且| |log2FC＞1的基因為顯著差異基因，將顯著差異的Unigene向GO數據庫的各條目映射進行功能分析，同時將Unigene與KEGG數據庫比對確定基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。結合兩種富集分析結果，篩選需要的差異基因。

1.3.4 反轉錄與熒光定量

使用全式金公司生產的Uni All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA。使用NCBI中premier designing tools設計篩選出的與金絲草葉片抗氧化酶相關的耐Pb基因對重金屬Pb脅迫響應的引物，如表2所示。

表2 候選基因名稱及定量引物序列Table 2 Candidate gene names and primer sequences used in qRT-PCR

使用福州都拜特生物技術有限公司的QuanStu-dio3 System熒光定量PCR儀，反應體系為：上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 1 μL，2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 10 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，共20 μL。反應過程為94℃30 s，94℃5 s，60℃30 s，共40個循環。每個樣品設3個生物學重復，每個生物學重復設3個技術重復，使用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.4 數據處理

使用SPSS 25軟件，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）和Tukey's post-hoc檢驗對試驗數據進行多重比較。抗氧化酶活性與分子生物學指標均做3次重復試驗，試驗結果用平均值±標準差表示。采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 Pb脅迫對金絲草葉片抗氧化酶活性的影響

不同Pb脅迫濃度下，金絲草葉片抗氧化酶活性的變化如圖1所示。隨著Pb濃度的增加，金絲草葉片POD酶活性呈上升趨勢，Pb1000、Pb2000處理下的POD酶活性顯著大于CK及其他處理（P＜0.05），分別比CK處理提高10.16%、10.27%。Pb脅迫下，金絲草葉片CAT酶活性隨Pb濃度的增加而增加，且Pb2000、Pb1000及Pb500處理下的酶活性顯著大于CK處理（P＜0.05），分別是CK處理的2.14、1.90倍和1.82倍。葉片SOD酶活性則是隨著Pb濃度的增加呈逐漸上升的變化規律，且Pb1000、Pb2000處理的酶活性顯著大于CK處理（P＜0.05），相較于Pb1000處理，Pb2000處理下的SOD酶活性提高了18.54%，二者差異顯著（P＜0.05）。隨著Pb濃度增加，金絲草葉片MDA含量總體呈上升趨勢，與CK處理相比，Pb500、Pb1000處理下的MDA含量分別提高了0.57、1.30倍，差異顯著（P＜0.05），但Pb2000處理下的MDA含量顯著低于其他處理（P＜0.05）。由此可見，金絲草葉片可能通過抗氧化酶響應及MDA含量的變化來適應Pb脅迫，不同抗氧化酶通過不同響應方式提高植物耐性，減少Pb脅迫對植株的毒害。

圖1 不同Pb脅迫濃度對金絲草葉片抗氧化酶活性和MDA含量的影響Figure 1 Effects of different Pb stress concentrations on antioxidant enzyme activities and MDA content in the leaves of P.crinitum

2.2 測序結果

由于Pb濃度為1 000 mg·L-1處理的金絲草葉片抗氧化酶活性變化顯著，故選擇對照（CS）處理與1 000 mg·L-1Pb脅迫（TS）處理的金絲草葉片樣品進行高通量轉錄組測序，每組3個重復，共6個樣品，測序結果如表3所示。兩組樣品經組裝、過濾后得到總堿基數共56.34 Gb，GC比例為57.37%～58.06%，堿基組成平衡。各樣品堿基質量值達到Q20以上水平的堿基數目占比均大于95%，達到Q30以上的堿基數目占比均大于90%，說明各樣品測序質量高，達到建庫要求。

表3 金絲草葉片轉錄組測序結果分析Table 3 Analysis of transcriptome sequencing data of P.crinitum

2.3 差異基因表達

通過Deseq2軟件分析TS與CS處理金絲草葉片的差異表達基因，基于差異分析結果篩選FDR＜0.05且|log2FC|＞1的基因為顯著差異基因（圖2）。分析發現TS與CS處理金絲草的葉片Unigenes共有3 282個差異基因（DEGs），其中有1 626個上調基因和1 656個下調基因。由圖3可知，金絲草耐Pb相關基因在CS與TS處理下差異顯著。與CS處理組相比，TS處理組與抗氧化酶相關的基因（POD、CAT、SOD、GSH、Unigene0049346、Unigene0015966、Unigene0002954、Unigene0032786和Unigene0041749等）表達上調，與Pb脅迫下金絲草葉片抗氧化酶活性變化趨勢一致。除此之外，金屬硫蛋白（MTs）、蛋白激酶（Kinase）、類甜蛋白（Thaumatin-like protein）、BOX、ZIP、NAC轉運蛋白、ABC轉運蛋白和轉錄因子等均為上調表達，這些可能也與提高植物抗逆性來適應Pb脅迫有關；葉綠體多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，chloroplastic）、蛋白質線粒體（Protein mitochondrial）和組織蛋白酶（Cathepsin）等則為下調表達，這類基因與植株機能代謝有關，說明Pb脅迫下植株部分機能受損。

圖2 CS-vs-TS差異火山圖Figure 2 CS-vs-TS difference volcano map

圖3 金絲草耐Pb差異基因（DEGs）表達量熱圖Figure 3 Heat map of the expression of some Pb-tolerant DEGs in the leaves of P.crinitum

2.4 差異表達基因的GO富集

將差異表達基因與GO數據庫比對進行注釋與富集分析，進一步了解Pb脅迫下DEGs的功能。共有1 032條DEGs富集在GO數據庫，這些基因所富集的GO條目可分為生物學過程（Biological process）、細胞組分（Cellular componet）和分子功能（Molecular function）3大類（圖4）。在生物學過程方面，代謝過程（Metabolic process）、細胞過程（Cellular process）和單一有機物過程（Single-organism process）占主要部分，分別占30.52%、24.32%和20.93%。在細胞組分中，差異表達基因主要富集在細胞（Cell）以及細胞組成（Cell part）部分，均占富集在GO數據庫總DEGs的18.80%，其次為細胞器（Organelle）、膜（Membrane）。在分子功能方面，催化活性（Catalytic activity）富集的差異表達基因最多，占比27.71%，其次為連接（Binding），再次為轉運活動（Bransporter activity），其占比3.01%。這表明Pb脅迫下金絲草葉片可通過代謝、催化各類酶活性和轉運蛋白等方式適應重金屬毒害。共有143條DEGs富集在與抗氧化酶相關的36個GO條目上，包括“過氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“分子內氧化還原酶活性”“氧化活性”“過氧化物酶活性”“二硫氧化還原酶活性”“活性氧代謝過程”“過氧化氫代謝過程”“氧化還原輔酶代謝過程”“超氧化物代謝過程”“氧化還原工藝”“對活性氧的響應”和“對氧化應激的反應”等（表4），其中有82條DEGs顯著富集在GO功能中（P＜0.05），如“過氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“氧化還原酶活性，作用于CH-OH供體組”“氧化還原酶活性，作用于其他含氮化合物作為供體，鐵硫蛋白作為受體”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”。

表4 抗氧化酶相關基因的GO分析Table 4 GO analysis of antioxidant enzyme-related genes

圖4 Pb脅迫下金絲草葉片差異表達基因的GO富集分類圖Figure 4 GO enrichment classification map of differentially expressed genes in the leaves of P.crinitum under Pb stress

2.5 差異表達基因的KEGG富集

將DEGs與KEGG數據庫比對進行功能注釋與通路富集分析，共有476條DEGs被注釋到121條KEGG通路上，其中25條通路被顯著富集（P＜0.05）。如圖5富集散點圖所示，在“核糖體（Ribosome）”通路上的63條DEGs富集最為顯著（P＜0.05），占所有注釋到KEGG通路DEGs的13.24%。在“代謝通路（Metabolic pathways）”上參與的DEGs最多，共有225個，占比47.27%，其中主要富集在“碳代謝（Carbon metabolism）”“苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）”通路；其次為“次生代謝物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）”通路，占比31.51%，說明Pb脅迫下，葉片的代謝系統具有重要作用，體內碳代謝、苯丙氨酸代謝等均有明顯變化。DEGs在“苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）”“苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）”“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis）”和“過氧化物酶體（Peroxisome）”等抗氧化酶相關的通路上顯著富集（P＜0.05），共占比12.18%，金絲草葉片可能通過這些通路參與抗氧化過程，去除活性氧抵御Pb毒害。除此之外，還有一些DEGs被注釋到與抗氧化酶相關的“谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）”“抗壞血酸和醛糖代謝（Ascorbate and aldarate metabolism）”“植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）”“黃酮類生物合成（Flavonoid biosynthesis）”和“MAPK信號通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）”等通路上。

圖5 Pb脅迫下部分金絲草葉片差異基因的KEGG分析Figure 5 KEGG analysis of partial DEGs in leaves of P.crinitum under Pb stress

2.6 抗氧化酶相關基因的篩選與熒光定量驗證

結合DEGs的表達及功能注釋結果，從富集顯著（P＜0.05）并與抗氧化酶相關的GO條目與KEGG通路中篩選出差異顯著的與抗氧化酶相關的上調DEGs，如圖6所示（其引物見表2），共有PcCAT（Unigene0029007）、PcSOD（Unigene0041749）和PcPOD（Unigene0069373）3個候選基因。PcCAT、PcSOD參與“過氧化物酶體（Peroxisome）”通路，作用于抗氧化酶系統中的過氧化氫代謝，屬于過氧化物酶體靶向信號（PTS1 type），表示金絲草葉片受到Pb脅迫后，可能通過過氧化物酶體產生信號，促進抗氧化酶相關基因表達，恢復細胞穩態。PcPOD參與“苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）”通路，上、下游分別為酚類醇類、木質素類，表明金絲草葉片該候選基因可能參與了香豆醇（p-Coumaroyl alcohol）、松柏醇（Coniferyl alcohol）和芥子醇（Sinapyl alcohol）轉化為木質素（Lignin）的過程，從而響應Pb脅迫環境。

圖6 候選基因代謝通路富集圖Figure 6 Enrichment map of candidate gene metabolic pathways

為了驗證金絲草葉片轉錄組測序結果以及與抗氧化酶相關的候選基因，本試驗對篩選出的3個Pb脅迫下與葉片抗氧化酶相關的DEGs（PcSOD、PcCAT和PcPOD）進行表達量分析。如圖7所示，Pb1000處理下，基因PcSOD的相對表達量低于Pb500處理，除此之外，金絲草葉片過氧化物酶相關基因PcSOD的相對表達量隨著Pb脅迫濃度的增加呈線性上升的趨勢。隨著Pb脅迫濃度的增加，抗氧化酶相關基因PcCAT與PcPOD的相對表達量均顯著上調，且Pb2000處理下相對表達量達到最大。不同處理下各DEGs的相對表達量均顯著大于CK處理，這與轉錄組測序的結果一致，表明本試驗中轉錄組測序結果真實準確。

圖7 抗氧化酶相關基因PcSOD、PcCAT和PcPOD的相對表達量Figure 7 The relative expression of antioxidant enzyme-related genes PcSOD，PcCAT and PcPOD

3 討論

Pb脅迫影響植物正常生長，刺激植物產生活性氧（ROS），積累過剩的ROS會造成植株體內氧化損傷，MDA含量增加，甚至會造成細胞死亡[21]，植物對Pb毒害的主要防衛方式為提高植物抗氧化性[22]。有研究表明，在一定的Pb脅迫范圍內，玉蟬花（Iris ensataThunb.）葉片SOD、POD酶活性隨著Pb濃度的增加而增加，且在Pb濃度為800 mg·L-1時達到峰值，通過此種抗氧化系統調節方式使玉蟬花適應Pb脅迫[23]。本研究中，隨Pb脅迫濃度的增加金絲草葉片抗氧化酶（POD、SOD和CAT）活性總體呈上升趨勢。這可能是因為Pb脅迫激活了金絲草葉片抗氧化酶活性，通過提高SOD、POD和CAT酶活性來清除植株體內過多的ROS，提高植物抗氧化性，從而提高其耐Pb性，與MA?ECKA等[24]對芥菜的研究結果以及HELAOUI等[25]對紫花苜蓿的研究結果類似。MDA是植物膜脂化的產物之一，同時也反映了植株膜脂化程度[26]。本研究中，在一定范圍內，金絲草葉片MDA含量隨著Pb濃度的增加而增加，說明Pb脅迫對金絲草葉片造成了膜脂化損傷，刺激了抗氧化系統，且隨著濃度的增加該傷害程度增大。在Pb濃度為2 000 mg·L-1時，MDA含量顯著低于其他處理，可能是因為高濃度Pb脅迫對金絲草葉片的過氧化傷害嚴重且達到不可逆轉的程度，造成了細胞死亡；也可能是因為此時葉片中抗氧化酶清除了過量的活性氧，抗氧化抵御系統降低了膜脂化程度，從而提高植物耐性，與吳桂容等[27]及CEDENO等[28]的研究結果相似，使得超富集植物金絲草可在20 000 mg·kg-1的Pb脅迫環境下正常生長[10]。

目前，對金絲草分子生物學方面的研究較少，且在NCBI數據庫中沒有公開的關于金絲草基因組及轉錄組的數據。本研究通過RNA-seq測序技術對Pb脅迫和對照組的金絲草葉片進行測序，利用DESeq2軟件以表達量為依據，篩選出與金絲草葉片抗氧化酶相關的候選DEGs。將得到DEGs與GO數據庫比對并進行富集，發現DEGs最顯著富集的GO條目為代謝過程，其次為催化活性。這可能是因為植物響應外界刺激的主要方式之一為代謝物調控，通過代謝或生成次級代謝產物來抵御非生物脅迫[29]。Pb處理與CK處理的小麥幼苗的DEGs主要富集于免疫系統過程和代謝過程等，在分子功能方面主要富集于催化活性等[30]，這可能是因為植物通過催化抗氧化酶活性來適應環境壓力，與本研究結果一致。本研究中金絲草葉片的DEGs在“氧化還原酶活性”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”等GO條目中顯著富集，這是因為植物在非生物脅迫下會產生大量ROS，清除過量的ROS是植物適應脅迫毒害的主要方式，該反應最關鍵、最主要的影響因子是抗氧化相關酶[31]。除此之外，DEGs還在“氧化還原酶活性，作用于CH-OH供體組”上顯著富集，這可能是因為CH-OH作為常見的ROS，更容易獲取氫原子而引起氧化鏈式循環反應，造成脂質、蛋白質和DNA等多種損傷，加劇脅迫毒害[32]，因此抗氧化酶相關基因更集中作用在CH-OH供體組。本研究中，通過與KEGG通路數據庫比對并進行富集，發現CK處理與重金屬Pb脅迫處理的金絲草葉片DEGs主要富集在代謝通路和次代謝的生物合成等代謝途徑。這可能是因為非生物脅迫下，植物通過次生代謝物的生成，如細胞色素[33]等基因表達量上調，促進抗氧化酶活性提高，從而增加植物抗逆性[34]。Pb脅迫下，金絲草葉片DEGs在“苯丙氨酸代謝”“苯丙烷生物合成”和“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”等抗氧化酶相關的通路上顯著富集，這是因為黃酮、木質素等酚類化合物作為苯丙烷代謝的產物主要作用于清除植物體內多余ROS、提高植物抗氧化[35]，而苯丙氨酸作為主要的氨化酶參與該代謝過程[36]，因此金絲草葉片通過基因調控促進苯丙烷生物合成，提高自身耐性來適應Pb脅迫。本研究中葉片DEGs還顯著富集在“過氧化物酶體”通路上，這是因為Pb脅迫下植物體內過氧化物酶體會產生逆向信號響應脅迫[37]，同時過氧化物酶體也是產生與調節ROS的重要細胞器之一[32]。

本研究中篩選出的PcCAT、PcSOD抗氧化酶基因在“過氧化物酶體”通路上，作用于抗氧化系統中的PTS1信號，且均為上調表達。過氧化物酶體作為響應非生物脅迫的重要細胞器自身無法生成相關酶，需要靶向信號（PTS）指引酶分子前體進入過氧化物酶體中[38]。Pb脅迫可能刺激金絲草葉片中過氧化物酶體產生PTS1，推動核糖體定向運輸到過氧化物酶體中，促進PcCAT、PcSOD上調表達合成抗氧化酶，清除脅迫下金絲草葉片PcPOD在“苯丙烷生物合成”通路上調表達，這可能是因為PcPOD是木質素合成途徑中的上游基因，Pb脅迫下葉片中該基因的上調表達促進了酚類醇（香豆醇、松柏醇和芥子醇）向木質素轉化。木質素作為細胞壁的重要組分，其含量的增加意味著金絲草葉片通過抑制ROS產生[39]和增加細胞壁的強度[40]來提高植株對Pb脅迫的抗性，本研究結果與LU等[41]發現沙梨[Pyrus pyrifolia（Burm.f.）Nakai]通過抗氧化相關基因調控木質素代謝物質生成從而適應非生物脅迫一致。本研究發現，隨Pb脅迫濃度的增加，抗氧化酶相關基因PcSOD、PcCAT和PcPOD的相對表達量呈逐漸上升趨勢，這與研究發現隨Pb濃度的增加，金絲草葉片POD、SOD和CAT酶活性逐漸增加的趨勢基本一致，說明金絲草可能通過這些抗氧化酶相關基因調控植株酶活性使之適應Pb脅迫環境。但在Pb1000處理下，PcSOD的表達量的變化與該活性變化不一致，這可能是在該處理下有其他相關基因參與了SOD酶的調控。李蘭[42]通過研究發現，Cr脅迫促進油菜（Brassica napusL.）葉片的SOD、POD和ZS758（與CAT相關）的相關基因表達上調，與對應的酶活性變化趨勢一致。Cd脅迫下，小麥（Triticum aestivumL.）抗氧化系統起主要的解毒作用，植株體內POD、SOD和CAT基因表達量與酶活性明顯增加[43]。ZHAO等[44]對商陸（Phytolacca americanaRoxb.）的研究發現錳（Mn）、銅（Cu）會誘導植株POD等抗氧化相關酶基因表達，說明提高植物抗氧化能力是應對重金屬脅迫的重要策略。此外，結合轉錄組測序及注釋結果，金絲草抗氧化系統還受多種基因調控，后期應持續深入研究。

4 結論

（1）Pb脅迫下金絲草可通過提高過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性，清除活性氧自由基，從而適應Pb脅迫環境。

（2）Pb脅迫下，金絲草葉片差異基因主要集中在與代謝、催化活性相關的功能條目中，其中差異基因顯著富集在“氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“氧化還原酶活性，作用于CH-OH供體組”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”以及“苯丙氨酸代謝”“苯丙烷生物合成”“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”和“過氧化物酶體”等與抗氧化相關的GO條目與KEGG通路中。

（3）金絲草葉片抗氧化酶相關基因PcSOD、PcPOD和PcCAT的qPCR驗證結果與轉錄組測序結果一致，不同濃度Pb脅迫下其相對表達量與抗氧化酶活性變化趨勢基本一致，說明這3個基因參與了金絲草應對Pb脅迫的調控過程。