黃河三角洲不同生境土壤理化特性及細菌群落結構特征

吳桐桐，徐基勝，周云鵬，陳美淇，周談壇，郭偉，陳金林，趙炳梓*

（1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037；2.封丘農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家試驗站，土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008）

黃河三角洲是我國濱海鹽堿地的集中分布區(qū)之一[1]，有近50%的土地遭受不同程度的鹽漬化[2]。不同的鹽漬環(huán)境分布不同的植被類型[3]，黃河三角洲分布有翅堿蓬、檉柳、荻、苦楝、刺槐等耐鹽堿、耐干旱特性的植被[4-5]，從而形成不同的生境。受原生鹽漬化影響，不同生境土壤的生態(tài)系統(tǒng)普遍脆弱和敏感[3]，生態(tài)環(huán)境極易受到外界環(huán)境變化的影響。生態(tài)環(huán)境變化導致土壤理化性質發(fā)生改變[6]，同時又會引起微生物的變化[7]，而微生物群落結構和功能的變化又能反饋到不同的生境土壤中，從而影響生態(tài)系統(tǒng)結構和功能[1]。因此需要明確不同生境土壤的理化性質和微生物群落結構特征以反映黃河三角洲不同生態(tài)系統(tǒng)的功能。

土壤鹽度被認為是濱海地區(qū)土壤質量的主要限制因子[8]，最能夠反映土壤理化性質的變化[9]。一般認為土壤鹽堿程度低則土壤質量高，反之亦然[7，10]。除鹽堿程度外，地勢地形、植被類型、土地利用方式、生物因素等[5，11]都對土壤理化性質產(chǎn)生重要影響。在這些生物和非生物因素影響下，黃河三角洲土壤表現(xiàn)為在一些高鹽地區(qū)養(yǎng)分含量也較高。如在一些研究中發(fā)現(xiàn)[12-13]，黃河三角洲潮間帶與淡水區(qū)域土壤全磷含量無顯著變化，并且沿海地區(qū)土壤速效鉀含量遠遠高于內(nèi)地。王娜娜等[11]的分析結果表明黃河三角洲128個采樣點除了有鹽大肥低和鹽小肥高類型的土壤外，還有鹽大肥高類型的土壤；同樣在東北鹽堿地中也有研究表明重度鹽堿土壤的有效磷含量高于輕度和非鹽堿土[14]。以上研究結果表明生態(tài)系統(tǒng)中鹽漬化和土壤養(yǎng)分等性質間具有復雜的關系[11-14]，土壤鹽分對養(yǎng)分的定量影響尚未明確，不能僅僅從鹽堿程度判斷土壤的其他性質特征。

土壤鹽漬化同樣也會影響土壤微生物群落結構[7，13-15]。鹽分可以提高細胞外的滲透勢，引起養(yǎng)分不平衡，降低酶活性從而對微生物造成毒性[16]。當前鹽漬化對微生物性質和微生物群落特征的影響主要集中于微生物數(shù)量[10]、微生物多樣性[1，17-18]、優(yōu)勢微生物或微生物群落差異[1，7，14，19]的研究上，而對黃河三角洲生態(tài)系統(tǒng)中的關鍵物種研究相對較少，尤其是關鍵物種在不同生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的作用[20-21]還不夠清晰。在微生物生態(tài)網(wǎng)絡中具有最高中介中心性值的物種往往對于維系整個生態(tài)網(wǎng)絡的穩(wěn)定性，發(fā)揮生態(tài)功能具有重要作用，可認為是關鍵物種[20，22]。關鍵物種的缺失會導致整個微生物群落的結構和生態(tài)功能發(fā)生巨大變化[21]。因此關鍵物種的識別對于進一步了解微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的作用具有重要意義。顏培等[7]研究了黃河三角洲鹽漬土區(qū)的真菌群落結構，認為子囊菌門（Ascomycota）可能是重要的關鍵物種。GUAN等[23]研究了我國松嫩平原蘇打鹽漬土細菌群落結構，發(fā)現(xiàn)輕度蘇打鹽漬土中的關鍵物種主要是分類于變形菌和擬桿菌的OTU，與中度和重度蘇打鹽漬土中的關鍵物種不同。但黃河三角洲不同生態(tài)系統(tǒng)中細菌的關鍵物種及其功能尚不明確。

為此本研究以黃河三角洲不同鹽漬化土壤為研究對象，旨在探討從近海到內(nèi)陸隨鹽漬程度降低和生態(tài)環(huán)境的變化土壤養(yǎng)分等性質和細菌群落結構是如何響應的，并識別各生態(tài)系統(tǒng)中的關鍵物種，在深入揭示鹽堿土的微生物過程機制方面具有一定的理論意義，研究結果可為進一步開發(fā)鹽堿地生態(tài)系統(tǒng)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于黃河三角洲，地處山東省東營市墾利區(qū)，屬暖溫帶季風性大陸氣候，四季分明，光照充足，雨熱同期。年均氣溫12.88℃，無霜期196 d，年均降水量537.3 mm，年均蒸發(fā)量2 000～2 400 mm[17，19]。主要土壤類型為鹽化潮土和潮鹽土，成土母質為黃河沖積物[7，17]。從近海到內(nèi)陸主要植被為翅堿蓬、檉柳、蘆葦、荻、苦楝等不同耐鹽程度的植物群落[4，7]。

1.2 土壤樣品采集

通過野外實地調查，2020年5月選取黃河三角洲區(qū)域從近海到內(nèi)陸30 km范圍內(nèi)四種不同生境的土壤（編號S1～S4）作為研究樣本，如圖1所示。其中S1樣地位于黃河入海口濱岸潮灘（119°13'06″E，37°43'25″N），主要植被為翅堿蓬；S2和S3樣地向內(nèi)陸延伸，距離S1樣地分別約為20 km（119°03'13″E，37°45'50″N）和10 km（119°08'21″E，37°44'42″N），主要植被分別為檉柳和荻；S4樣地位于黃河口鎮(zhèn)興無村附近（118°53'12″E，37°42'04″N），距離S1樣地約30 km，主要植被為苦楝。每個樣地設置1 m×1 m的樣方，去除土壤表層動植物殘體和石塊等雜質后在樣方內(nèi)采用梅花型五點采樣法采集5個位置的表層土壤（0～20 cm），混合均勻為一個樣品。每個樣地設有5個重復，共采集20個樣品。所有樣品儲存于自封袋，在放有冰袋的保溫箱中低溫保存，然后送至實驗室。每個樣品分為三部分，一部分樣品風干過篩處理后用于土壤基本理化性質測定，一部分鮮樣過篩處理后用于微生物生物量碳（MBC）和可溶性有機碳（DOC）測定，一部分存于-80℃冰箱用于土壤DNA提取及細菌群落測定。

圖1 取樣點分布圖Figure 1 Distribution map of sampling points

1.3 土壤理化性質測定

土壤基本理化性質測定方法：使用pH計（FE20，Mettler Toledo，德國）測定pH值；電導率（EC）采用電導率儀測定；土壤有機碳（SOC）和全氮（TN）分別用重鉻酸鉀氧化-外加熱法和凱氏定氮法測定；全磷（TP）和全鉀（TK）用氫氟酸-高氯酸消化后，分別用鉬藍法和火焰光度計（FP640，華燕，中國）測定；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用靛酚藍比色法測定；有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定；速效鉀（AK）采用醋酸銨浸提-火焰光度計法（FP640，華燕，中國）測定；可溶性有機碳（DOC）按水土比5∶1浸提，用TOC分析儀（Multi N/C 3100 TOC/TN，Jena，德國）測定；微生物生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸浸提法測定。各指標測定方法和計算詳見參考文獻[24]。

1.4 土壤細菌群落測定

土壤 總DNA采用FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals,Santa Ana,美國）試劑盒提取。每個樣品稱取0.50 g鮮土，按照說明書操作提取DNA。選取特征 引 物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3'）16S rRNA基因V3和V4區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增條件：94℃預變性2 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，30個循環(huán)之后，68℃延伸5 min。反應產(chǎn)物采用AMPure XP Beads進行純化，純化后用Qubit 3.0定量，并進行第二輪擴增。第二輪擴增條件：94℃預變性2 min，98℃變性10 s，65℃退火30 s，68℃延伸30 s，12個循環(huán)之后，68℃延伸5 min。反應產(chǎn)物用AMPure XP Beads進行純化，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies，美國）進行定量，根據(jù)Novaseq 6000的PE250模式上機測序。

1.5 統(tǒng)計分析

高通量測序得到的結果采用QIIME等軟件進行分析，首先對原始FASTQ文件進行質控、拼接、過濾去除嵌合體序列得到高質量序列。基于97%相似度水平，通過聚類分析得到細菌序列的可操作分類單元（OTU，Operational taxonomic units）。選取最優(yōu)勢序列作為代表性序列，與RDP數(shù)據(jù)庫進行比對獲得物種注釋信息。利用Mothur軟件計算多樣性指數(shù)Shannon和Simpson。主坐標分析（PCoA）和多元回歸樹（MRT）分析分別用R軟件中的ape和Vegan數(shù)據(jù)包進行計算。使用Mantel檢驗方法評估土壤性質對微生物群落（OTU水平）的影響。利用R軟件中的psych包進行OTU-OTU的網(wǎng)絡分析，用Gephi軟件進行網(wǎng)絡可視化，根據(jù)中介中心性值確定關鍵物種[20]。

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，對土壤理化性質、細菌多樣性指數(shù)、細菌群落進行單因素方差分析，檢驗不同處理間的差異顯著性（P＜0.05）。對關鍵OTU和土壤性質的關系進行Pearson相關性分析。采用Origin Pro 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 土壤基本理化性質

土壤基本理化性質見表1。四種土壤均為堿性，pH在8.71～9.38之間。土壤間EC呈顯著性（P＜0.05）差異；從近海到內(nèi)陸，EC從5 504.4 μS·cm-1降低為150.68 μS·cm-1。S1的EC值分別是S2、S3和S4的4.8、9.6倍和36.5倍，是所有土壤性質中變異最大的參數(shù)。按照鹽漬土不同等級指標[25]，S1為重度鹽漬土，S2為中度鹽漬土，S3為輕度鹽漬土，S4為非鹽漬土。

從近海到內(nèi)陸隨鹽度變化，SOC、全量養(yǎng)分和速效養(yǎng)分均發(fā)生明顯變化（表1）。SOC和TN都表現(xiàn)出從S1到S4逐漸增加的趨勢；且S1中的含量顯著（P＜0.05）低于S4，但與S2和S3無顯著性差異。TP在S1和S4中含量較高，且顯著（P＜0.05）高于S2和S3。TK含量在S1樣品中最高，且顯著（P＜0.05）高于其他樣品；隨鹽堿程度降低TK含量也降低，但在S4土壤中又呈升高趨勢，且顯著（P＜0.05）高于S2和S3土壤。相關性分析結果表明，TK含量與EC極顯著正相關（r=0.769，P＜0.01）。

表1 不同生境土壤基本理化性質Table 1 Soil basic physiochemical properties in different habitats

土壤速效養(yǎng)分表現(xiàn)為S1樣品的AP和AK含量均最高，且顯著高于其他樣品（P＜0.05），而NO-3-N含量顯著低于其他樣品（P＜0.05）。隨土壤鹽堿程度降低，S2和S3的AP和AK含量也降低，但在S4樣品中含量又呈上升趨勢，且與S2無顯著性差異。AP和AK含量均與EC極顯著正相關（r值分別為0.745和0.955，P＜0.01）。隨鹽堿程度降低，NO-3-N含量整體呈增加趨勢，但在S2樣品中達到峰值，且與S4無顯著性差異。NO-3-N含量與EC呈極顯著負相關（r=-0.666，P＜0.01）。NH+4-N含量則在土壤間無明顯變化規(guī)律。

DOC和MBC均為活性碳源。S1和S2樣品的DOC含量較低，隨鹽堿程度增加，DOC含量有增加趨勢，但只有S3樣品顯著高于S1和S2。S1的MBC含量最低，且顯著低于其他樣品。隨鹽堿程度增加，MBC含量整體呈增加趨勢；與S1相比，S2和S3的MBC含量增加了3.9倍，S4增加了6.4倍。

2.2 土壤細菌多樣性和群落組成

2.2.1 土壤細菌群落多樣性

四種土壤中S1的微生物多樣性最低（表2），香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均顯著低于其他樣品（P＜0.05）。從近海到內(nèi)陸隨鹽堿程度降低微生物多樣性增加，但在S4樣品中又呈降低趨勢。S2和S3的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均達到最大，且二者之間無顯著性差異。

表2 不同生境土壤細菌群落的多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity indexes of soil samples in different habitats

2.2.2 土壤細菌群落組成

四種生境土壤20個DNA樣品共獲得858 485條高質量的序列，每個樣品序列數(shù)在42 767～43 025之間，分屬35個門和1 090個屬。其中優(yōu)勢細菌門（平均相對豐度大于5%）為浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），這些門占序列總數(shù)的77.0%～88.1%（圖2）。芽孢單菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）這四個門的平均相對豐度為1%～5%，占序列總數(shù)的7.8%～16.7%。各組樣品的最優(yōu)勢菌門不同，重度鹽漬土S1樣品變形菌相對豐度最高（27.0%），其次為放線菌（18.1%）和浮霉菌（16.3%）；中度鹽漬土S2和非鹽漬土S4樣品放線菌相對豐度最高（分別為27.4%和31.3%），其次為浮霉菌（22.3%和17.4%）和變形菌（20.1%和18.7%）；輕度鹽漬土S3樣品則是浮霉菌相對豐度最高（36.9%），其次為變形菌（21.0%）和放線菌（15.4%）。

圖2 不同生境土壤細菌群落組成和主坐標分析Figure 2 Relative abundances of bacterial phyla in different habitats and PCoA of soil bacterial community composition

基于OTU水平、Bray-curtis距離的PCoA分析表明，不同生境土壤的細菌群落組成具有明顯的特異性，前兩軸共解釋了74.6%的群落變異（圖2），Adonis2結果也說明不同處理之間存在顯著差異（P＜0.05）。S1樣品沿第一軸與其余三組樣品明顯分開，S2、S3和S4沿第二軸分開。

分析各組樣品相對豐度最高的前10個屬，共獲得23個屬，占微生物總豐度的35.79%～43.91%（表3）。其中有5個優(yōu)勢屬（平均相對豐度大于1%）普遍存在于四組樣品中，占微生物總豐度的9.29%～22.35%，均為未知的屬。另外S1樣品還有7個特異的優(yōu)勢屬，占微生物總豐度的20.14%，包括unclassified_BD2-11_terrestrial_group（3.96%）和Woeseia（2.70%）等。S2、S3和S4三組樣品除S3有2個特異的優(yōu) 勢 屬Blastopirellula（2.82%）和Planctomicrobium（1.63%）外，其他樣品間的優(yōu)勢屬均高度重合，其中有4個 優(yōu) 勢 屬unclassified_Geminicoccaceae、unclassified_Gemmataceae、unclassified_Subgroup_6和unclassified_JG30-KF-CM45存在于三組樣品中，4個優(yōu)勢屬Nocardioides、Marmoricola、unclassified_Gemmatimonadaceae和unclassified_WD2101_soil_group共存 于S2和S4樣品中。

2.3 環(huán)境因子對土壤細菌群落的影響

基于OTU和環(huán)境因子的Bray-curtis距離矩陣之間的Mantel檢驗結果表明環(huán)境因子對細菌群落組成有顯著影響（r=0.954，P=0.001，圖3）。為了進一步探究影響細菌群落結構的主要環(huán)境因子，我們進行了MRT分析。MRT共解釋了細菌群落變異的80.70%，其中MBC解釋了62.50%的變異。細菌群落首先由MBC分為兩大組，第一組為鹽堿程度最高的S1樣品，第二組為另外三組樣品（中度鹽漬土S2、輕度鹽漬土S3和非鹽漬土S4）。根據(jù)EC值，第二組細菌群落可進一步分為兩小組（解釋11.72%群落變異），其中鹽堿程度最低的S4為一小組，中度鹽堿土S2和輕度鹽堿土S3為另一小組。該分組結果與PCoA相一致。以上結果表明從近海到內(nèi)陸，MBC和EC是調控細菌群落的關鍵因子。

圖3 細菌群落和土壤性質間距離矩陣的相關性分析及細菌群落的多元回歸樹分析Figure 3 The correlation between distance matrix of bacterialOTUs and that of soil properties,and multiple regression treeanalysis of the effects of soil properties on bacterial communities

2.4 分子生態(tài)網(wǎng)絡分析

2.4.1 網(wǎng)絡特性分析

分析了四種生境土壤的細菌共發(fā)生網(wǎng)絡（圖4）的拓撲結構參數(shù)，包括節(jié)點數(shù)、連接數(shù)、平均度、圖密度、平均聚類系數(shù)和平均路徑長度，各參數(shù)具體數(shù)值見表4。各網(wǎng)絡的模塊化指數(shù)均大于0.4，表明群落具有模塊結構。其中重度鹽漬土S1網(wǎng)絡的節(jié)點數(shù)和連接數(shù)均最小；從近海到內(nèi)陸隨鹽堿程度降低，節(jié)點數(shù)和連接數(shù)整體也呈增加趨勢，但在非鹽漬土S4網(wǎng)絡中又有所降低。平均度、圖密度和平均聚類系數(shù)也表現(xiàn)出類似的規(guī)律，即在S1和S4網(wǎng)絡中較低，而在S2和S3網(wǎng)絡中較高；而平均路徑長度表現(xiàn)為相反的規(guī)律，即在S1和S4網(wǎng)絡中較高，在S2和S3網(wǎng)絡中較低。這說明在近海重鹽堿（翅堿蓬）和內(nèi)陸非鹽堿（苦楝）生態(tài)系統(tǒng)中，物種群落相對穩(wěn)定；而在中度（檉柳）和輕度（荻）鹽堿系統(tǒng)中細菌群落間的相互作用更強，種間關系更為復雜，物種間的物質信息傳遞效率更高，對外界環(huán)境也更為敏感，響應迅速，群落結構容易發(fā)生變化。

表4 不同生境土壤微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡的拓撲性質Table 4 Topological properties of co-occuring bacterial networks obtained among the soils in different habitats

細菌分子生態(tài)網(wǎng)絡由4～7個模塊組成，主要為變形菌門、放線菌門和浮霉菌門（圖4）。其中S1網(wǎng)絡有6個模塊，變形菌門（平均相對豐度20.8%）豐度最高；S2和S4網(wǎng)絡分別有5個和7個模塊，均為放線菌門（22.6%和25.6%）相對豐度最高；S3網(wǎng)絡有4個模塊，浮霉菌門（24.3%）相對豐度最高。

圖4 不同生境土壤細菌分子生態(tài)網(wǎng)絡Figure 4 Networks of co-occuring bacterial OTUs in the soils of different habitats

2.4.2 關鍵物種及其與環(huán)境因子的相關性

根據(jù)中介中心性選擇每個網(wǎng)絡的前10個OTUs作為關鍵物種。與優(yōu)勢物種不同，這些關鍵物種均互相獨立，沒有重復。重度鹽漬土S1網(wǎng)絡中的關鍵物種主要為變形菌和酸桿菌，包括OTU002085（屬于Vibrio）和OTU000979（Geothermobacter）等。這些關鍵物種整體上與EC、TK、AK和AP顯著正相關，而與MBC和NO-3-N顯著負相關（圖5）。中度鹽漬土S2的關鍵物種主要為變形菌、酸桿菌和放線菌，包括OTU000585（Candidatus_Entotheonella）和OTU000199（Amaricoccus）等。輕度鹽漬土S3的關鍵物種主要為浮霉菌和變形菌，包括OTU000015（Methyloceanibacter）、OTU000313（Rhodopirellula）和OTU000138（Luteolibacter）等。S2和S3的關鍵物種主要與EC顯著負相關，同時還與TP、TK、AK顯著負相關。S2的關鍵物種還與MBC、NO-3-N顯著正相關。非鹽漬土S4關鍵物種主要為變形菌、綠彎菌和酸桿菌，包括OTU001724（Achromobacter）、OTU000610（Nordella）和OTU000841（Gemmata）等。這些關鍵物種整體上與EC顯著負相關，與MBC、SOC、TN和NO-3-N顯著正相關。

圖5 關鍵OTU豐度與土壤性質間的相關性Figure 5 Correlation coefficients between keystones and soil properties

3 討論

3.1 不同生境土壤的理化性質特征

本研究涉及黃河三角洲四種生境土壤，不同的土壤環(huán)境適應不同的植被類型。大量研究表明土壤和植被系統(tǒng)具有相互選擇適應性[3]。本研究從近海到內(nèi)陸，主要植被由翅堿蓬過渡到檉柳、荻和苦楝，符合黃河三角洲植物群落的分布格局[26]。從近海到內(nèi)陸植物的演替規(guī)律通常反映在土壤鹽分的遞減上[26]，同時土壤鹽分又被認為是濱海地區(qū)土壤質量的限制因子[8]。

本研究通過土壤EC反映土壤的鹽分水平[14]，發(fā)現(xiàn)從近海到內(nèi)陸EC是變化最大的土壤參數(shù)（表1），EC值的變動伴隨土壤其他性質的變化，EC一方面與NO-3-N和MBC顯著負相關，另一方面與AP、TK和AK含量顯著正相關。NO-3-N含量隨EC的增加而降低，可能是因為鹽度增加影響了土壤氧的供應，從而導致硝化反應速率下降[27]。高鹽分還會引起滲透壓的升高導致部分微生物死亡，從而降低MBC含量[15]。我國不同地區(qū)的鹽漬土，如濱海鹽漬土[9]、內(nèi)蒙古河套灌區(qū)鹽漬土[28]和東北蘇打鹽漬土[14]均有報道隨鹽分的升高MBC含量降低。

EC與AP、TK和AK等養(yǎng)分在數(shù)值上呈顯著正相關，但二者之間并不一定有機理上的直接聯(lián)系，也可能通過其他環(huán)境因素的影響而外化為數(shù)值上的相關性。張喚等[10]研究發(fā)現(xiàn)重度鹽堿化堿蓬草地土壤的AP含量大于中度鹽堿化蘆葦土壤中的含量，可能是因為隨著草地覆蓋量的增加植被對土壤AP的利用也不斷增加，從而導致土壤中AP含量的減少。本研究中翅堿蓬樣地的AP含量高于其他樣地，可能是由于采樣期翅堿蓬植株較小，覆蓋度很低，對土壤AP的利用有限。本研究中土壤TK和AK含量整體屬于較高水平，與其成土母質為黃河沖積物有關[11]。濱海地區(qū)鉀含量的分布還與地勢地形有關[11]；灘涂地帶靠近海域，地下水位較高，鉀含量一般都較高。結合遙感影像和實地調查數(shù)據(jù)，路景鈁等[12]模擬了黃河三角洲AK含量的空間分布，發(fā)現(xiàn)沿海區(qū)的AK含量一般遠高于內(nèi)陸地區(qū)。

綜上所述，鹽漬土的養(yǎng)分含量并不一定低于非鹽漬土，養(yǎng)分含量受多方面因素影響，除鹽漬條件外還包括地勢地形、植被類型、土地利用方式等[5，11]。但MBC一般受鹽分影響較大，較高的鹽分往往不利于微生物的生長，從而導致微生物生物量的降低[15]。

3.2 不同生境土壤細菌群落的共性和特異性

本研究中四種生境土壤的細菌群落均以變形菌、浮霉菌和放線菌為主，與前人對黃河三角洲區(qū)域的研究報道類似[1，18-19]。但不同土壤細菌群落間均表現(xiàn)出一定的差異性。整體而言，重度鹽漬土S1樣品的細菌群落組成與另外三組樣品的差異最大，反映在細菌群落的PCoA圖上（圖2）。對各組樣品相對豐度最高的前10個屬合計23個屬進行分析也得到類似的結果，S1樣品的特異優(yōu)勢屬最多（7個），而S2～S4樣品間則有更多的共性屬（9個）。S1樣品的特異優(yōu)勢屬中僅有一個可識別的屬為Woeseia（分類于γ變形菌），該物種在濱海濕地中均有報道[17，29]，可參與脫硫和反硝化過程對濕地養(yǎng)分循環(huán)有重要作用[30]。其他重要的屬包括unclassified_BD2-11_terrestrial_group（芽單胞菌）和unclassified_Nitriliruptoraceae（放線菌），其中Nitriliruptoraceae具有耐鹽性，能夠分解腈基類物質[13,31]。可見近海翅堿蓬區(qū)域的土壤微生物通常富集有耐鹽的微生物，同時這些微生物參與養(yǎng)分循環(huán)，對維持該區(qū)域養(yǎng)分具有重要作用。S2～S4三組土壤樣品間共存的優(yōu)勢屬包括Nocardioides（分類于放線菌）和unclassified_Gemmataceae（浮霉菌）。其中Nocardioides是一種根際益生菌[32]，能降解多種有機物質[18]。Gemmataceae科是一種好氧化能微生物，可廣泛存在于濕地、土壤等多種生態(tài)環(huán)境中，其生態(tài)功能尚未完全清楚，某些屬可利用糖和雜多糖如木聚糖、海帶多糖等[33]。

土壤細菌群落的特異性還體現(xiàn)在關鍵物種的差異上。利用網(wǎng)絡分析的中介中心性參數(shù)確定了關鍵物種，中介中心性對于維持網(wǎng)絡的連通性非常重要[20]。篩選出的四組樣品關鍵物種均不同，這一點與樣品間存在共性優(yōu)勢屬不同，說明僅僅從優(yōu)勢屬單個層面上反映個體微生物的信息還不夠，還需要分析對整個微生物群落網(wǎng)絡有影響的關鍵物種。關鍵物種不一定是優(yōu)勢物種，但對于整個微生物生態(tài)網(wǎng)絡的形成以及發(fā)揮生態(tài)功能有至關重要的作用[20]。

重度鹽漬土S1的主要關鍵物種包括OTU002085和OTU000979，分別屬于Vibrio（分類于γ變形菌）和Geothermobacter（δ變形菌），更多的關鍵物種則是未知的屬。其中Vibrio在黃河三角洲濕地中有報道[1]，可以降解石油污染物[34]，還具有解磷功能[35]，這和本研究中OTU002085與AP顯著正相關的結果相一致（圖5）。Geothermobacter則具有鐵還原功能[36]。中度鹽漬土S2網(wǎng)絡的關鍵物種包括OTU000585和OTU000199，分別屬于Candidatus_Entotheonella（腸桿菌）和Amaricoccus（α變形菌）。其中Candidatus_Entotheonella可通過產(chǎn)生抗生素和多酮類物質來抑制病原菌[37]，還能促進硝化過程[38]。Amaricoccus為化能異養(yǎng)微生物，可以降解多種有機物[39]。輕度鹽漬土S3網(wǎng)絡的關鍵物種包括OTU000015（α變形菌中Methyloceanibacter）、OTU000313（浮霉菌中Rhodopirellula）和OTU000138（疣微菌中Luteolibacter）。其中Methyloceanibacter為甲基營養(yǎng)型嗜鹽菌，可分解有機物[40]。Luteolibacter可參與植物對有機質的分解利用過程，還能對某些植物真菌性病害有拮抗作用[41]。Rhodopirellula在碳氮循環(huán)中也有重要作用[42]。非鹽漬土S4網(wǎng)絡的關鍵物種包括OTU001724（γ變形菌中Achromobacter）、OTU000610（α變 形 菌 中Nordella）和OTU000841（浮霉菌中Gemmata）。其中Achromobacter可溶解不溶性的無機磷酸鹽，參與生物固氮，促進生物量的提升[43]。Nordella屬于根瘤菌目，也能發(fā)揮生物固氮作用[6]。Gemmata是一種功能菌，可增加脲酶的活性，從而促進有機物的分解[41]。可見不同的生態(tài)環(huán)境塑造的關鍵物種也不同，這些關鍵物種都能一定程度上對有機物分解和養(yǎng)分循環(huán)起到作用，從而維持彼此相應的生態(tài)系統(tǒng)。

無論是優(yōu)勢屬還是關鍵物種都僅有少量的微生物有明確的分類，這極大限制了對黃河三角洲微生物群落及其生態(tài)功能的認識，但同時也暗示黃河三角洲蘊含著豐富的未培養(yǎng)微生物資源。最新研究表明地球上大部分微生物類群仍未得到很好的描述，這些未知的微生物通常被稱為“微生物暗物質”[22]。本研究發(fā)現(xiàn)重度鹽漬土S1的未知關鍵物種可能主要受鹽度正向調控以及NO-3-N負向調控，與其他生境網(wǎng)絡的未知關鍵物種受環(huán)境調控的方向不同（圖5）。進一步識別這些微生物暗物質及其功能可為黃河三角洲微生物資源的開發(fā)和利用提供參考。

3.3 不同生境土壤細菌群落與環(huán)境因子的相關性

土壤細菌群落結構和土壤環(huán)境因子密切相關[1，14，44]，同時植物可以通過凋落物和根系對土壤細菌群落尤其是根際微生物產(chǎn)生一定的影響[37，45]，但植物本身的影響往往不如土壤性質[46-47]。另一方面，地上植物性質的變化一定程度上已經(jīng)反映在土壤性質中[45，48]，因此本節(jié)重點探討土壤環(huán)境因子和細菌群落間的相關性。這種相關并不是單一的，一方面各環(huán)境因子對微生物群落可能存在直接的影響，另一方面各環(huán)境因子本身之間可能存在內(nèi)在關聯(lián)，會通過耦合效應來影響微生物群落的結構。通過多元回歸分析可以找到影響目標變量的最佳預測變量。

從整個微生物群落看，影響黃河三角洲四種生境土壤細菌群落結構的關鍵因子依次為MBC、EC和AP（圖3）。MBC對細菌群落結構變化的解釋率最高，可能是由于MBC對從近海到內(nèi)陸環(huán)境的變化較為敏感，從數(shù)值上看MBC的變異性僅小于EC和AK（表1）。MBC對環(huán)境的敏感性可能直接體現(xiàn)在微生物群落結構的變化上。類似地，JI等[44]研究發(fā)現(xiàn)有機肥替代化肥十年的茶園土壤中，對土壤微生物群落變化解釋率最高的是MBC，其次是其他養(yǎng)分指標。

EC對微生物群落結構的影響與前人的研究結果一致[1]。一般認為EC對細菌生長有負面影響，可以通過影響細胞滲透性，引起養(yǎng)分不平衡，降低酶活性，甚至對微生物造成毒性[16]。不同微生物對鹽分的耐受性和敏感性不同，由此造成土壤中整個微生物群落結構不同。EC還可能影響到各生態(tài)環(huán)境中關鍵物種的存在，本研究重度鹽漬土S1的關鍵物種大多數(shù)都與EC顯著正相關（圖5），說明這些關鍵物種對高鹽環(huán)境有很好的適應性。相對地，S2～S4關鍵物種雖然不同但大多都表現(xiàn)出與EC顯著負相關，說明內(nèi)陸樣本的關鍵物種主要適應于中度鹽分以下的環(huán)境。

AP的匱乏則可能影響到土壤微生物的群落結構，因為磷是微生物進行生命活動的必需關鍵元素之一[49]，而本研究中土壤AP含量很低。路景鈁等[12]用ARCGIS模擬了黃河三角洲AP的空間分布，也發(fā)現(xiàn)其含量嚴重偏低。本研究結果暗示AP對整個微生物群落結構的影響超過了有機質和其他養(yǎng)分的影響。但這并不意味著其他養(yǎng)分性質對微生物就沒有影響。本研究發(fā)現(xiàn)重度鹽漬土S1樣本的關鍵物種主要與AK顯著正相關，而與NO-3-N顯著負相關（圖5）；S2～S4樣本則反之，說明AK和NO-3-N對關鍵物種有較大的影響。未來將增加實驗以加強關于網(wǎng)絡關鍵物種受環(huán)境因素調控機制的研究。

4 結論

（1）從近海到內(nèi)陸土壤性質存在差異。近海的重度鹽漬土電導率（EC）是內(nèi)陸非鹽漬土的36.5倍。隨鹽堿程度降低，土壤微生物生物量碳（MBC）和硝態(tài)氮（NO-3-N）含量明顯增加，說明微生物生物量對生態(tài)系統(tǒng)的變化有很高的敏感性；全鉀（TK）、速效鉀（AK）和有效磷（AP）在鹽漬土壤中的含量明顯高于非鹽漬土，說明鹽漬化并不一定引起土壤質量的全面退化。

（2）不同生境土壤的細菌群落結構存在差異。重度鹽漬土S1土壤樣品含有更多的特異優(yōu)勢細菌，其微生物群落結構與其他三組樣品最為不同。網(wǎng)絡分析結果顯示四種土壤均含有獨特的關鍵物種，其生態(tài)功能各有不同。細菌群落結構和關鍵物種均與環(huán)境因子有關。除MBC外，EC和AP對細菌群落結構的解釋率最高，且大多數(shù)關鍵物種與EC和NO-3-N顯著負相關，而與AK顯著正相關。因此，在考慮生態(tài)系統(tǒng)功能時也應該關注微生物網(wǎng)絡中的關鍵物種。

致謝：特別感謝中國科學院南京土壤研究所陳林老師和段衍博士在樣品采集上提供的幫助。