混合青貯微生物多樣性研究進展

宗亞倩， 韓 博， 段新慧， 周 凱， 何承剛， 姜 華

(云南農業大學動物科學技術學院， 云南 昆明 650201)

青貯作為一種保存飼料的手段已有3 000多年的歷史，是常見的保存牧草的方法，可以減少牧草損耗，保障青綠飼料全年平衡供應[1-5]。隨著我國北方草地退化，土地沙漠化程度擴大，飼料短缺成為限制畜牧業發展的主要因素[6]。許多學者因地制宜，利用一些非常規飼料資源(如農作物秸稈、糧經副產物、輕工業生產的副產品等)進行生產混合青貯飼料，不僅可以發展節糧型畜牧業，還能緩解飼草原料短缺帶來的壓力，這也是當今世界飼料發展的一種趨勢[7-8]。混合青貯是將兩種或兩種以上原料混合在一起，利用乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)發酵來實現長期保存青綠飼料的一種存貯方式[9-10]。其通過原料之間的互補作用，來增加有益微生物數量或抑制不良發酵，進而提高青貯品質[11-12]。混合青貯作為一種貯存技術，具有延長飼料儲存時間、調節水分和糖分、增加原料的利用價值、調整飼料供應時期、提高飼草消化率和動物適口性等優點。從擴大資源利用率、減少環境污染、提高農副產品的附加值等角度來看，混合青貯十分必要[7]。

青貯飼料擁有一個復雜的微生物體系，主要由原料表面附著微生物、發酵微生物和腐敗微生物參與[13]。對于混合青貯飼料而言，良好的微生物發酵環境是調制成高品質青貯飼料的關鍵，微生物群落組成及其動態演替直接影響發酵品質[14]。現有研究表明，在可能影響青貯發酵的眾多因素中，微生物類型通常決定了青貯飼料的最終質量[15-16]。因此，為更好預防青貯飼料品質下降，本文就青貯飼料發酵過程中的微生物群落及演替過程進行詳細闡述，分析混合青貯飼料中優勢微生物組成，闡明影響混合青貯微生物多樣性的原因，為調制優質的混合青貯飼料提供科學依據。

1 青貯微生物群落組成與演替過程

青貯是各種微生物共同作用的結果[17-18]，而參與發酵的微生物主要來源于牧草表面附著的微生物，其在青貯發酵過程中具有重要作用。附著的微生物中除了有促進青貯飼料發酵的乳酸菌外，還有引起青貯腐敗變質的微生物，主要有梭菌屬(Clostridium)、醋酸菌(Acetobacter)、酵母菌、霉菌等[19]。植物表面環境的特殊性，使得植物表面附著的微生物種類和數量隨植物生長環境的不同存在顯著差異[20-22]。但是一般來說，這些青貯原料一旦進行密封青貯后，其在發酵和貯藏過程中發生生理生化和微生物菌群的變化大致相似。如表1所示，在青貯發酵過程中微生物種類和數量是呈動態變化的，通常青貯原料表面附著的好氧細菌、腸桿菌、酵母菌和霉菌等微生物數量較多。在開始時，青貯環境中還有氧氣的存在，這時好氧細菌生長旺盛。同時，球狀的鏈球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)和片球菌(Pediococcus)也在活動，進行乳酸發酵后，乳酸菌開始大量增殖并產生乳酸，其后隨著厭氧和酸性環境的形成，好氧的和不耐酸的微生物逐漸減少，逐漸被乳桿菌(Lactobacillus)和片球菌共同取代，成為乳酸發酵的優勢菌[23-26]。Ennahar等[27]發現，在青貯飼料發酵早期主要的優勢菌群為片球菌，糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，隨后被乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)等更耐酸的乳酸菌代替。在籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)與全株玉米(Zeamays)混合青貯前后微生物種類和數量的研究中發現，其微生物也存在這樣的演替規律，在新鮮樣品中以乳酸球菌的腸球菌(Enterococcus)、乳球菌(Lactococcus)、類腸膜明串珠菌(Leuconostoc)為優勢菌群。經過青貯發酵后，乳酸桿菌演替為優勢菌群，并且經青貯發酵乳酸菌數量增加，大腸桿菌和霉菌消失，而酵母菌數量變化較小[28]。蔣慧[29]將駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap.)與紫花苜蓿(MedicagosativaL.)按不同比例進行混合，比較混貯前后乳酸菌和酵母菌總數的變化，發現青貯后乳酸菌數量顯著高于青貯原料，酵母菌數量顯著低于青貯原料。在青貯發酵過程中，原料本身的營養成分是保證飼料發酵成功的重要部分。但是，微生物的群落結構及其演替過程也同樣重要，所以了解這些信息可有效調控青貯飼料的發酵過程，為調制優質的青貯飼料提供技術支持。

表1 青貯發酵過程不同微生物菌群變化[23-26]Table 1 Changes of microbial communities during silage fermentation[23-26]

2 混合青貯微生物多樣性

有些原料因自身種類、含水量、化學成分等原因，常規青貯難以調制成優質青貯飼料，必須要與其他原料混合青貯才能達到發酵條件。混合青貯可調和水分、提升營養價值、改善適口性和提高發酵品質等，其常見原料包括常規牧草，各種飼料作物以及農、輕工業副產物等(米糠、甜菜渣、麥麩、各種酒糟以及水果渣等)。目前研究集中在單一青貯中微生物活動特性上[30]，而對于混合青貯對發酵體系內微生物的影響報道較少，混合青貯如何通過改變微生物特性提高青貯成功率尚不明晰。

2.1 高蛋白飼草與高糖類飼草混合青貯

禾本科牧草水溶性碳水化合物含量高、緩沖能低，蛋白質含量少，單獨青貯往往致青貯營養品質不佳。像紫花苜蓿這樣的豆科牧草因水溶性碳水化合物含量低，蛋白質含量和緩沖能高，單獨青貯較難成功，常常會導致梭菌等有害微生物活動旺盛[31]。但是將其與禾本科牧草進行混合青貯，兩者互補可達到較好的青貯效果[32-33]。青貯過程中微生物群落變化，可能是導致青貯質量差異的關鍵因素，對此學者們對豆科牧草與禾本科牧草混合青貯中的微生物群落組成進行了深入的研究。張朝陽[34]用富含蛋白質的草木樨(MelilotussuavcolenL.)分別與青綠玉米、玉米秸稈和小麥(TriticumaestivumL.)秸稈混合青貯，發現其優勢微生物組成和豐富度各不相同，與青綠玉米混合青貯主要以乳桿菌屬為主；與玉米秸稈混合青貯主要是以魏斯氏菌屬(Weissella)為主；而與不同比例的小麥秸稈混合青貯優勢菌不同，以克雷伯氏菌屬(Klebsiella)或植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬為主。一般來說，禾本科牧草的水分和自帶的微生物種類不同，進而導致混合青貯飼料優勢菌不同。飼用大豆(Glycinemax)分別與玉米和高粱(Sorghum)混合青貯后，乳酸菌和魏斯氏菌屬是所有青貯樣品的優勢菌[35]。Li等[36]在三葉草與多花黑麥草(LoliummultiflorumL.)混合青貯中發現乳桿菌為其優勢菌，其次為片球菌和芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus)。紫花苜蓿與全株玉米以不同比例混合青貯，細菌群落發生改變，當玉米從0%增加到40%時，乳桿菌的相對豐度增加，根瘤菌(Rhizobium)和甲基桿菌(Methylobacterium)數量減少，混合全株青貯玉米后可以增加啟動發酵的優勢菌的相對豐度[37]；在紫花苜蓿與甜高粱(Sweetsorghum)不同比例混合青貯中分離出19株乳酸菌，分別是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、植物乳桿菌、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)、腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconstocmesenteroidessubsp.mesenteroides)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)[38]。將富含蛋白質的構樹(Broussonetiapapyrifera)與多年生黑麥草(LoliumperennL.)進行混合青貯，能夠提升乳桿菌和魏斯氏菌等有益微生物在整個青貯發酵過程中的主導地位，減少腸桿菌的數量，為反芻動物的可持續生產提供良好的飼草資源[39]。

用富含蛋白質的牧草與富含可溶性碳水化合物的飼料進行混合青貯，可以提升營養成分，更有利于有益微生物的生長繁殖。雖然同一混合青貯類型微生物組成存在差異，整體來說，混合青貯可以更好地保存飼料營養價值。

2.2 高水分青貯原料與干飼料混合青貯

在農產品生產與加工過程中會有大量秸稈、尾菜、酒糟、薯渣、果渣等農副產品和輕工業副產品生成。大多數的農副產品纖維素含量高，營養品質差，含水量低。而多數的輕工業副產品正好與之相反，具有較高的營養價值，蛋白質含量高，是優質的粗飼料來源，但是含水量高，不易單獨青貯。高水分青貯往往面臨出水流失和梭狀芽孢桿菌發酵的高風險，導致大量干物質損失、蛋白質分解嚴重、丁酸產量高，從而降低飼料消化率、氮利用率和家畜的采食量[40-41]。將這兩者混合青貯可以互相彌補彼此的不足，調節微生物族群，減少不良微生物的豐度，提高發酵質量[42]。如在稻草與黑麥草混合青貯過程中優勢菌主要有植物乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)、食竇魏斯氏菌(W.cibaria)、短乳桿菌，隨著青貯時間延長，優勢菌數量下降[43]。李夢玉[44]從不同發酵時間的玉米秸稈與廢棄白菜(Brassicapekinensi)混合青貯的飼料中，檢測出腸桿菌(Enterobacter)、乳桿菌、肉食桿菌(Carnobacterium)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、泛菌(Pantoea)、明串珠菌等近27個細菌屬。但并不是所有玉米秸稈和白菜混貯飼料中優勢菌都是相同的，李志忠等[45]從中分離得到優勢菌群卻是植物乳桿菌、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)和短乳桿菌，混貯發酵體系中的乳酸桿菌較乳酸球菌豐富。戚如鑫[46]發現稻草與白菜尾菜混合青貯后的優勢屬主要有乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬(Lactococcus)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、克雷伯氏菌屬、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)等。任海偉等[47]將白酒糟和菊芋渣(HelianthustuberosusL.)進行混合發酵，通過高通量測序技術解析發酵微生物菌群多樣性發現，混合發酵以厚壁菌門乳桿菌屬細菌為主。王聰[48]將甜高粱秸稈和酒糟混合青貯發現乳桿菌屬和片球菌屬為屬水平優勢菌。Ren等[49]在玉米秸稈與甘藍(BrassicaoleraceavarcapitataL.)廢棄物的混合青貯飼料中發現乳酸桿菌和明串珠菌為優勢乳酸菌，在混合青貯過程中抑制了腸桿菌科、假單胞菌、黃桿菌和泛菌等不良微生物的生長。玉米與蕎麥(Fagopyrumesculentum)混合青貯飼料中，優勢菌群有假單細胞菌屬、乳桿菌屬、泛菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、貪銅菌屬(Cupriavidus)、乳球菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬(Serratia)[50]。高水分玉米莖稈和柱花草(StylosanthesguianensisSw.)與洋紫荊(BauhiniavariegateL.)花莖混合青貯后細菌多樣性增加，腸桿菌和梭菌的相對豐度降低，乳桿菌、威瑟拉菌和腸球菌等產乳酸細菌的相對豐度增加[51]。

3 混合青貯微生物多樣性影響因素

3.1 混合比例和原料對微生物的影響

在青貯發酵過程中，微生物主要來自青貯原料表面天然微生物群落。微生物菌群因飼料作物的特性以及環境條件的不同，使得飼草本身附著微生物群落結構有著顯著的差異[34,52]，因此不同混合比例、不同青貯原料的青貯發酵體系中微生物結構也各不相同。

就混合比例而言，兩種青貯原料參與青貯的比例不同，一方面會改變整個青貯體系中優勢菌群的豐度，另一方面會改變青貯原料的營養成分。這些改變都會引起混合青貯飼料中微生物菌群結構發生變化。商振達等[50]以全株蕎麥與全株玉米為青貯原料進行混合青貯，發現兩者以不同比例進行混合青貯60 d后，優勢菌屬和豐度值均發生改變。李茂雅等[53]在探究皇竹草(PennisetumsineseRoxb)與茅臺酒糟不同混合比例對微生物多樣性的影響中發現，兩者混合青貯后優勢菌屬雖均為乳桿菌屬，但是隨著茅臺酒糟混合比例的降低，青貯飼料中乳桿菌屬的相對豐度逐漸增高，在90%皇竹草+10%茅臺酒糟青貯中，乳桿菌屬相對豐度最高。

由此可以看出，兩種原料按不同比例進行混合青貯，青貯體系中微生物的組成和豐度值會產生較大的改變，引起這些變化的原因可能與原料本身的含水量、可溶性糖以及有益菌豐度等密切相關。

從青貯原料來看，不同植物由于表面微環境的特殊性，附生或寄生于植物表面的微生物群體存在一定差異，與不同原料進行混貯后微生物多樣性也會隨之發生改變。Ni等[35]分析了飼用大豆與玉米、高粱混合青貯對微生物群落的影響，結果表明，乳桿菌和魏斯氏菌雖是所有青貯樣品中的優勢微生物，但它們的相對豐度各不相同，且飼用大豆+高粱所有青貯中乳桿菌的豐富度均高于飼用大豆+玉米青貯。將紫花苜蓿與全株青貯玉米進行混合青貯后，細菌群落主要由乳酸桿菌、威塞拉菌和片球菌組成[54]。韓吉雨等[55]在探究苜蓿和玉米青貯中得出的結論是原料表面附著的細菌貫穿整個發酵過程，說明原料本身附著的微生物對青貯微生物多樣性影響很大。

3.2 青貯時間對微生物多樣性的影響

同一飼料不同發酵時期微生物種類和豐富度是處在一個不斷變化的狀態，青貯前、貯藏期以及開窖之后差異顯著。孫安琪[56]證實了白酒糟原料附著的細菌主要是乳桿菌、伯克氏菌(Burkholderia)、不動桿菌(Acinetobacter)、志賀氏菌(Shigella)等，菊芋渣原料附著的主要是乳桿菌，兩者混合青貯10 d時，優勢細菌以乳桿菌和芽孢桿菌屬為主，30和60 d時，優勢細菌均以乳桿菌屬為主，且隨著青貯時間的延長乳桿菌豐富度不斷增加。劉蓓一等[57]以稻草秸稈和多花黑麥草為青貯原料，以不同比例進行混合青貯，觀察了其不同發酵時期青貯微生物的動態變化，發現不同青貯時期乳酸菌、酵母菌和霉菌數量不同且隨著青貯時間延長，優勢菌數量下降。盧強等[58]分析了紫花苜蓿不同發酵時期的微生物群落，發現同樣規律，在發酵初期乳球菌屬和腸球菌屬發揮主要作用，在發酵后期，乳酸桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬占主導優勢，并且腸桿菌屬及霉菌等數量減少，乳球菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬等在不同階段的豐度值有較大區別。青貯發酵是微生物動態變化的過程，在發酵過程中微生物會產生一些代謝產物[59]，使整個青貯環境的發生改變，微生物為適應當時環境，在種類和數量上隨之改變。

4 存在的問題與展望

近年來隨著我國畜牧業的快速發展，飼料供應不足已成為限制畜牧業可持續發展的重要因素。混合青貯飼料因其營養全面，原料來源廣，逐漸被大家所認知并成為研究熱點。目前，關于混合青貯的研究主要集中在混合青貯對發酵品質及微生物多樣性的影響，對于乳酸菌抗菌性研究、混合青貯飼料的推廣利用以及對動物生產性能研究仍存在不足之處。

4.1 乳酸菌抗菌性研究

乳酸菌廣泛用應于食品、醫療和養殖等多個領域中，是公認的安全級微生物，在人和大多數動物腸道內都有存在，具有抑制細菌和真菌的特性。研究表明乳酸菌代謝產物具有較廣的抑菌作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等都有很好的抑制作用，能減緩有害微生物生長速度、延長微生物停滯期、減少微生物成活數量，增強免疫力和保護機體的作用[60-62]。目前，對于乳酸菌抗菌性的研究主要集中在泡菜、冷鮮豬肉等食品中，而關于混合青貯中乳酸菌抗菌活性的研究較少，從不同地域和不同混合青貯飼料中篩選具有抑菌活性的乳酸菌并研究其抑菌機理將會成為未來研究的重要方向。

4.2 混合青貯推廣

混合青貯可以實現原料互補，提高青貯品質，增加有益微生物數量，降低飼養成本，獲得優質畜產品，緩解飼料短缺帶來的壓力，具有很大的開發潛力。由于非常規飼料資源存在季節性、分布不集中、產業化程度低等因素的影響，使之推廣利用程度比較低。目前，非常規飼料資源的各種性能沒有得到全面的開發和利用，今后應關注糧經副產物集中回收管理與利用、混合青貯配比技術研究，為混合青貯飼料的科學合理利用提供理論依據。

4.3 混合青貯對動物生產性能研究

青貯飼料在反芻動物養殖中起到不可或缺的作用。近年來，隨著混合青貯飼料的興起，學者們進行了廣泛的關于動物生產性能的研究，如日增重、產奶量、飼料轉化率以及產蛋、乳量。未來應進一步關注混合青貯微生物群落變化對動物瘤胃微生物的影響，如何促進動物生長、調控腸道健康、改善奶制品和肉制品質量的具體作用機理以及不同生長階段混合青貯飼料的合理喂養量等方面的研究，為混合青貯飼料利用提供一定的理論基礎。