接種AMF替代磷肥促進退化草地黃花苜蓿的補播建植

李春玥， 馬 飛， 楊高文， 劉 楠， 張英俊

(中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100193)

草地是牧民維持生計的重要物質基礎，是發展畜牧業的重要保障[1]，同時也是我國重要的生態屏障。但是由于過度放牧、人為的不合理利用以及氣候條件等因素，導致草地生態系統退化、物種多樣性損失、牧草品質下降[2-3]、草畜矛盾激化等[3]。目前，我國約90%天然草原處于不同程度的退化之中，其中重度退化草原占60%以上[3-4]，因此，退化草地的恢復和改良迫在眉睫[5]。草地免耕補播是更新、復壯草群的有效措施之一，通過在退化草地中免耕補播適宜的優良草種，解除了種子限制，在不擾動或少擾動原生植被的前提下，增加草原植被覆蓋度、物種多樣性，從而提升退化草原生產力并提高牧草質量[6-8]。

在采用補播措施對退化草地進行修復的過程中，應選擇適宜的植物作為補播物種[8]。在退化草地中補播豆科植物能夠發揮植物本身的固氮作用，使豆科牧草具有較高的粗蛋白含量，有助于提高草地的生產力和牧草品質；此外，豆科植物具有水分利用率高、凋落物含氮量高等優點，有助于提高植物群落對干擾的抵抗力、改善土壤碳氮循環和增加土壤肥力等優點[9-12]。黃花苜蓿(Medicagofalcate)作為天然草地補播的優良豆科牧草[13]，具有較多的水平根，單株覆蓋面積大，且抗寒抗旱性強，能夠提高天然草地的生產力[14]、改善牧草品質[15]、影響群落結構和提升物種多樣性[14]。

施肥作為草地管理的重要手段，對于草地生態系統生產力的維持極為重要。有研究表明，施加氮肥能在短期內提高草地生產力[16]，在退化草地群落中施加氮肥提高了多年生根莖禾草的生產力和優勢度，但物種豐富度略有下降[7]。Zhou等[17]研究表明，施加磷肥促進豆科牧草的建植，提高了紫花苜蓿(Medicagosativa)和黃花苜蓿的生物量，維持植物群落多樣性的同時提高了植物生產力，從而促進了退化草原的恢復。退化草地植物群落對施肥的響應與退化程度、植物物種種類和土壤理化性質等有關[18]，不同植物物種對施肥的響應有所差異。此外，施肥不僅會影響地上植物群落的多樣性和生產力，也會對土壤微生物結構和功能產生顯著影響[19-20]。同時，我國磷資源面臨短缺，過量施用磷肥會造成土壤污染等不利影響[21]。

土壤微生物在草地生態系統中占有重要的地位[22]，如叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)和根瘤菌(Rhizobium)等植物共生菌能夠促進植物生長。AMF能夠與80%以上的維管植物共生，對于提高植物養分吸收、增強植物的抗逆性、改善土壤結構、促進幼苗定植以及影響物種間的相互作用具有重要作用，進而能夠提高草原生產力和改變植物多樣性[23-25]。然而，有研究表明不同植物對AMF的菌根依賴性不同，多年生暖季型C4禾草和非禾草的菌根響應積極，而冷季型C3禾草接種AMF后無顯著影響[26]。根瘤菌作為自然界中常見的微生物，能與豆科植物形成共生關系，為宿主植物提供氮素，提高草地生產力，是群落中豆科植物維持的關鍵因子[27]。因此，在草原的補播修復過程中，接種植物共生菌可能有助于豆科牧草的建植。已有研究發現，豆科植物進行根瘤菌和AMF雙接種比單接種的生長表現和抗病能力更好，并且在有AMF的情況下豆科植物的結瘤數目增加[28-29]。此外，Zhou等[30]研究發現，根瘤菌和AMF雙接種對植物群落生產力和豆科植物的生長和結瘤有明顯的促進作用。基于以上研究，我們提出能否利用接種植物共生菌替代施肥促進補播群落中黃花苜蓿的建植？

為回答這一科學問題，本研究選取天然草原羊草(Leymuschinensis)和冷蒿(Artemisiafrigida)作為禾本科和雜類草代表物種，以黃花苜蓿作為補播豆科植物代表物種。通過室內盆栽試驗來研究三種代表物種對接種植物共生菌或施肥的響應，并探究接種植物共生菌或施肥處理對補播植物群落生產力以及群落結構的影響。我們的研究結果將為草地補播改良技術提供科學根據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用室內盆栽試驗，選取羊草、冷蒿和黃花苜蓿三種不同功能群植物物種構建補播群落。采用兩因素析因試驗設計，其中接種共生菌包括4個水平:不接種(-AMF-R)、接種根瘤菌(-AMF+R)、接種叢枝菌根真菌(+AMF-R)和雙接種(+AMF+R)，施肥包括4個水平:對照(CK)、添加氮(N)、添加磷(P)和氮磷同施(NP)。共16個處理，每個處理重復5次，共80盆。

1.2 試驗材料

1.2.1種子采集及萌發 本試驗所用羊草和冷蒿種子均采自內蒙古草甸草原，黃花苜蓿種子采自內蒙古呼倫貝爾海拉爾區謝爾塔拉牧場二隊。種子采回后用10% H2O2處理10 min，去除種子表面可能存在的微生物。用蒸餾水洗凈后，在滅菌石英砂中進行萌發培養，為保證水分充足，每隔3天澆水一次。

1.2.2培養基質準備與植物共生菌接種 于內蒙古呼倫貝爾海拉爾區草地農業生態系統試驗站采集0～10 cm土層的土壤，并過2 mm篩。對于接種AMF的處理:將土壤與河沙以3∶1均勻混合后裝入花盆(高:17 cm，直徑:15 cm)，每盆2 kg。沙土培養基質全氮含量為0.29%，土壤速效磷含量為19 mg·kg-1。對于不接種AMF處理:將土壤裝入滅菌袋，置于高溫高壓蒸汽滅菌鍋(LS-50HV，江陰濱江醫療設備有限公司)中，在121℃下，滅菌60 min，并在24 h后用相同方法再滅菌一次，以保證滅菌效果；對河沙也用上述方法進行滅菌，將滅菌土壤與滅菌河沙按照3∶1比例均勻混合后，每個花盆裝入裝2 kg，并加入70 mL除AMF外的土壤微生物濾液。微生物濾液的制備:將未滅菌土壤按土水比1∶2攪拌混合，用直徑25 μm的篩子過濾，由于AMF孢子大于25 μm，過濾液不含AMF[31]。在接種AMF的花盆中加入70 mL水，以保證試驗設計符合唯一差異性原則。試驗所用根瘤菌由中國農業大學菌根小組提供，名稱為中華苜蓿根瘤菌sm1021(Sinorhizobiummeliloti1021)。對于接種根瘤菌的處理，每盆接種4 mL根瘤菌液，于幼苗移栽后用移液槍將菌液注入黃花苜蓿根部。

1.2.3幼苗移栽培養與施肥處理 種子萌發約25天后進行移栽。每盆每種植物各移栽兩株，共六株植物，隨機均勻分布于一個花盆中。花盆在溫室中隨機排列，每15天換一次位置。溫室白天溫度為20～30℃，夜晚為15～25℃。每4天澆水100 mL，并于每周加入100 mL·盆-1改良過的McKnight營養液，每升該營養液含有:300 mg KCl;887 mg CaCl2;200.4 mg MgSO4·7H2O;0.22 mg ZnSO4·7H2O;0.079 mg CuSO4·5H2O;3.61 mg MnCl·4H2O;2.86 mg H3BO3;10.293 mg FeSO4·7H2O;0.144 mg NaMoO4·2H2O。根據Zhan等[32]在內蒙古草原的施肥試驗研究，確定氮磷肥的添加量，用KH2PO4和NH4Cl分別進行氮磷養分的處理，氮養分添加量為26.17 mg·kg-1，磷養分添加量為14.57 mg·kg-1，氮磷同施為二者之和，該施肥量為中等施肥水平。氮磷添加分兩次進行，每次添加一半，第一次添加在幼苗移栽初期，第二次在植株生長兩個月后添加。

1.3 取樣及測定

植物生長到4個月后，測定植物地上和地下生物量。從植物根部分種剪下，用于測定各植株的地上生物量。對于植物的地下部，將根系放入網篩緩慢沖洗干凈，保存至4℃冰箱，用于測定根系菌根侵染率、苜蓿根部結瘤情況以及地下生物量。

1.4 統計分析

所有原始數據用Microsoft Excel 2016進行整理，用Shapiro.test函數進行正態分布檢驗，用線性模型(lm)進行雙因素方差分析，檢驗接種植物共生菌、施肥處理以及二者交互作用對補播群落的地上生物量、菌根侵染率、群落生物量比例等指標的作用，采用Duncan法進行多重比較對不同共生菌接種和不同施肥處理下的指標在95%的置信區間上進行顯著性分析。采用tidyverse進行數據操控，用ggplot2進行數據可視化，所有的數據分析和作圖在R-4.1.3版本下進行。本研究所有的原始數據和R代碼可以通過figshare獲取(DOI:10.6084/m9.figshare.19711621)。

2 結果與分析

2.1 植物共生菌接種或施肥對補播群落植物生物量的影響

與不接種(-AMF-R)相比，接種AMF(+AMF-R)和雙接種(+AMF+R)均顯著降低了補播群落植物的總地上和地下生物量(圖1，P<0.001)。與不接種(-AMF-R)相比，接種AMF(+AMF-R)與雙接種(+AMF+R)時補播群落地上生物量顯著降低了26.57%(P<0.001)，但接種AMF(+AMF-R)和雙接種(+AMF+R)處理間群落的地上生物量無顯著差異(圖1a)。對于補播群落植物的地下總生物量，與不接種(-AMF-R)相比，接種AMF(+AMF-R)或雙接種(+AMF+R)分別顯著降低了31.90%和16.56%(P<0.001)；在不接種(-AMF-R)，接種AMF(+AMF-R)與雙接種(+AMF+R)處理下，施肥處理對補播群落的地下總生物量無顯著影響(圖1b)。

圖1 植物共生菌接種或施肥對地上生物量和地下生物量的影響Fig.1 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the total aboveground and belowground biomass注:不同大寫字母表示不同接種處理間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示不同施肥處理間差異顯著(P<0.05)，下同；***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05；ns表示P>0.05Note:Different capital letters indicate significant differences among different inoculation treatments at the 0.05 level;different lowercase letters indicate significant differences among different fertilization treatments at the 0.05 level,the same as below;***, P<0.001;**, P<0.01;*, P<0.05;ns,P>0.05

與-AMF-R相比，+AMF-R或+AMF+R使補播群落中黃花苜蓿的地上生物量分別顯著增加了919.78%和945.06%(P<0.001)，但+AMF-R和+AMF+R間黃花苜蓿的地上生物量無顯著差異；在-AMF-R時，P與CK相比，黃花苜蓿的地上生物量顯著提高了465.93%(P<0.001)，但在+AMF-R時，施肥對黃花苜蓿的地上生物量無顯著影響；在+AMF+R時，P與CK相比，黃花苜蓿的地上生物量僅顯著提高46.58%(圖2a，P<0.001)。與-AMF-R相比，補播群落中羊草的地上生物量在+AMF-R或+AMF+R時分別顯著降低了60.66%和60.36%(P<0.001)；在-AMF-R時，P與CK相比，羊草的地上生物量顯著增加了34.49%(P<0.01)；在+AMF-R時，P與CK相比，羊草地上生物量顯著增加了36.49%(圖2b，P<0.01)。與-AMF-R相比，+AMF+R時冷蒿的地上生物量顯著提高了35.02%(P<0.001)；但+AMF-R和+AMF+R處理間補播群落中冷蒿的地上生物量無顯著差異；在+AMF-R時，NP相比于其它施肥處理使冷蒿的地上生物量顯著提高了129.39%(圖2c，P<0.001)。

圖2 植物共生菌接種或施肥對黃花苜蓿、羊草和冷蒿地上生物量的影響Fig.2 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the aboveground biomass of M. falcate,L. chinensis and A. frigida

2.2 植物共生菌接種或施肥對植物菌根侵染率的影響

施肥均降低了補播群落中三種植物的菌根侵染率。在+AMF-R時，NP與CK相比，黃花苜蓿的菌根侵染率顯著降低了17.18%(P<0.05)；在+AMF+R時，NP與CK相比，黃花苜蓿菌根侵染率顯著降低了15.13%(圖3a，P<0.05)。在+AMF-R時，P與CK相比，羊草的菌根侵染率顯著降低了14.48%(P<0.05)；+AMF+R時，P與CK相比，羊草的菌根侵染率顯著降低了19.88%(圖3b，P<0.05)。與CK相比，P和NP處理使冷蒿的菌根侵染率分別顯著降低了12.11%和12.40%(圖3c，P<0.01)。

圖3 植物共生菌接種或施肥對黃花苜蓿、羊草和冷蒿菌根侵染率的影響Fig.3 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the mycorrhizal root colonization of M. falcata,L. chinensis and A. frigida

2.3 植物共生菌接種或施肥對黃花苜蓿結瘤的影響

與-AMF-R相比，-AMF+R、+AMF-R與+AMF+R時補播群落中黃花苜蓿的結瘤數分別提高了57.28%，345.63%和417.48%(P<0.001)，其中雙接種的效果最好；與CK相比，P和NP處理后黃花苜蓿的結瘤數量均分別顯著增加了51.75%(表1，P<0.001)。與-AMF-R相比，+AMF-R和+AMF+R顯著增加了黃花苜蓿的根瘤重(P<0.001)；與CK相比，P和NP處理后黃花苜蓿的根瘤重顯著增加了47.30%(P<0.01)。

2.4 植物共生菌接種或施肥對補播群落結構的影響

-AMF-R或-AMF+R時，黃花苜蓿在植物群落的占比為1.60%～1.80%，+AMF-R或+AMF+R時黃花苜蓿的地上生物量比例提高至22.10%～33.17%(圖4)。-AMF-R或-AMF+R時，羊草生物量比例均在80%以上；+AMF-R或+AMF+R時羊草的地上生物量比例下降為40.22%～57.20%；且在+AMF-R或+AMF+R時，施肥對羊草地上生物量比例的影響不顯著。與-AMF-R相比，-AMF+R處理對冷蒿的地上生物量比例無顯著影響，而+AMF-R和+AMF+R使冷蒿地上生物量比例顯著提高了150.40%(圖4，表2，P<0.001)，但+AMF-R和+AMF+R間無顯著差異；在-AMF-R處理下，P與CK相比使冷蒿的地上生物量比例顯著提高了86.87%(圖4，表2，P<0.05)；+AMF+R時，與CK相比，P或NP處理對冷蒿地上生物量比例的影響不顯著。

表1 植物共生菌接種或施肥對黃花苜蓿 結瘤數和結瘤重的影響Table 1 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the number and weight of M. falcate root nodules

表2 植物共生菌接種或施肥對物種生物量比例的影響Table 2 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the plant biomass composition

3 討論

通過研究植物共生菌接種或施肥如何影響補播豆科草地植物群落結構和生產力發現，接種AMF或雙接種均顯著降低了補播群落植物的地上和地下總生物量，主要是由于接種AMF或雙接種顯著增加了黃花苜蓿和冷蒿的生物量，而降低了羊草的地上生物量。原因可能是不同的植物種類與AMF建立的共生關系不同，前人研究表明，相比于C3禾草，豆科和雜類草的菌根依賴性更強[33]。并且在補播群落中植物會對共同利用的資源產生競爭，不接種植物共生菌時優勢種羊草在生長速度和生物量等方面都高于黃花苜蓿和冷蒿，導致黃花苜蓿和冷蒿在資源競爭中處于劣勢；而接種AMF或雙接種后顯著增加了黃花苜蓿和冷蒿的地上生物量，減輕了優勢種羊草對其他植物物種的競爭排除，幫助黃花苜蓿在補播群落中定植，并提高其在補播群落中所占比例，從而降低了羊草在補播群落中的優勢性。

圖4 植物共生菌接種或施肥對物種生物量比例的影響Fig.4 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the composition of plant communities

研究發現，施加磷肥或氮磷同施均顯著提高了補播群落的地上總生物量，這與Avolio等[34]研究結果一致。本研究中，在不接種共生菌時，施加氮肥對羊草和冷蒿的地上生物量無顯著影響，施磷肥則顯著提高了補播群落中羊草和冷蒿的地上生物量。有研究表明，豆科牧草由于生物固氮的功能，在低氮環境中更容易生長且對磷比較敏感[35]，這與本研究結果相符，即施加磷肥和氮磷同施均顯著增加了黃花苜蓿的地上生物量，提高了黃花苜蓿在群落中的所占比例。此外，有研究表明，在長期施肥試驗中，施加磷肥顯著提高了草地的地上凈初級生產力，同時改變了草地群落中功能群的組成[34]。

研究發現，與AMF建立共生關系后導致植物對施肥的響應發生改變。不接種時，與不施肥相比，施磷肥處理下黃花苜蓿的地上生物量顯著提高了465.93%，而在雙接種時，施磷肥與不施肥相比，黃花苜蓿的地上生物量僅顯著提高了46.58%。AMF與植物的共生關系會受到土壤養分的影響，養分越高共生效果越差甚至會產生負效應來抑制植物生長[36]。本研究中，三種植物的菌根侵染率在施肥后均出現不同程度降低，說明施肥減弱了寄主植物與AMF的共生關系，在氮磷富集的土壤中，植物吸收養分不會過多的依賴AMF，寄主植物對AMF的依賴性降低，相應的減少了寄主植物分配給AMF的碳水化合物和脂肪酸，菌根侵染率也隨之降低[37]，且隨著土壤磷含量的增加，AMF對寄主植物的吸磷貢獻率逐漸下降，說明土壤含磷量低時AMF對寄主植物益處越顯著[38]。接種AMF后黃花苜蓿的根瘤數目和結瘤重顯著高于未接種AMF，而且在施加磷肥時效果最好，即AMF能夠促進根瘤的生長。原因可能是接種AMF后為根瘤固氮提供了充足的營養及銅、鋅等微量元素，促進了根瘤菌的固氮能力[39-40]；其次，根瘤菌和AMF接種后，刺激了黃花苜蓿對碳的需求，使黃花苜蓿具有更高的光合作用和呼吸速率，提高了寄主植物供給AMF的碳含量[41]。研究表明，雙接種對寄主植物的促進作用要超過單接種，說明二者之間存在協同促進作用[42-43]，此外，Larimer等[44]人的研究同樣說明了雙接種對豆科的協同促進效應，這兩類共生菌會對群落中豆科的優勢度有顯著的影響。但是在本研究中卻顯示，接種AMF與雙接種對于補播豆科植物地上總生物量和黃花苜蓿地上生物量無顯著差異，這與試驗預期假設不一致，這可能是由于AMF的生長需要較高的光合作用和呼吸速率，從而抑制了根瘤菌的生長[41]。

4 結論

在退化草地采用免耕補播進行修復時，當不接種植物共生菌時，施磷肥均能提高黃花苜蓿、羊草和冷蒿的地上生物量，但當接種AMF時，施磷肥對補播群落中黃花苜蓿的作用則會下降。通過接種AMF能夠增加補播群落中黃花苜蓿的地上生物量，而降低羊草的地上生物量，從而提高黃花苜蓿的競爭力，有助于黃花苜蓿的補播建植以及補播后群落結構的維持。因此，考慮到我國磷資源的匱乏以及過度施用磷肥所產生的不利影響，可以通過接種AMF替代磷肥施用促進補播黃花苜蓿的建植。在未來的研究中，應該加強AMF菌株的篩選和開發，將AMF菌劑用黃花苜蓿的補播建植，為草地補播提供技術支持。