氮添加對青藏高原高寒草甸土壤磷組分的影響

韓 冰， 耿依儀， 鄧艷芳， 王宇飛， 周華坤， 邵新慶*， 李芝雯

(1.中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100193; 2.祁連山國家公園青海服務保障中心， 青海 西寧 810000; 3. 中國科學院西北高原生物研究所， 青海省寒區恢復生態學重點實驗室， 青海 西寧810001； 4.青海省祁連縣農牧 水利科技和鄉村振興局， 青海 西寧 810400)

磷作為影響陸地植物生產力的重要營養元素，是維持生態系統功能穩定的關鍵因素[1]。大部分磷被難溶性化合物吸附和固定，只有一小部分磷可被植物和微生物吸收利用[2,3]。尤其在石灰性土壤中，磷的流動性和生物有效性不能滿足植物的需求[4]。青藏高原是我國重要的生態安全屏障[5]，高寒草地占其總面積的53%，近1.4億公頃[6]。高寒草甸作為高寒草地的植被類型之一，多位于干旱和半干旱地區，且低溫限制了該地區氮、磷的礦化過程[7]，土壤中可被植物吸收利用的氮、磷含量缺乏[8]，養分限制模式為磷限制或氮磷限制。

氮是限制陸地生態系統初級生產力的關鍵營養元素[9]。額外添加氮素可以增加土壤中的無機氮含量從而提高植物生產力。有研究表明，氮添加會通過增加地上植物的生產力從而增加植物對土壤有效磷的需求，從而加重了陸地生態系統(包括森林、草地、濕地和苔原)的磷限制[10]，同時植物也會釋放羧酸鹽來調控土壤磷周轉[11]。氮添加條件下土壤理化性質的變化也影響著土壤磷的轉化。有研究得出土壤硝態氮是驅動不穩定有機磷變化的重要因素[12]，氮添加通過積累硝酸鹽致使土壤酸化[13]，促進了石灰性土壤中磷酸鹽的溶解[14]，但在酸性土壤中，土壤pH值的降低會促進土壤中的金屬陽離子(如鋁和鐵)與磷形成難溶化合物，從而抑制酸性土壤中有機磷礦化成為有效磷的過程[15]。氮添加還會通過改變微生物群落影響微生物對有效磷的吸收[16]及土壤磷酸酶的活性[17]。

為維持和提高高寒草地生態系統的穩定性和適應性，施用氮肥是常見的養分管理措施之一[18]。在高寒草甸開展的一些長期施肥試驗研究結果表明，氮添加極大的促進了地上生物量的提高[19]。目前的研究主要通過測定高寒草甸土壤中全磷和有效磷含量去分析土壤磷在氮添加處理下的變化特征[20-21]，但對于土壤磷的各組分之間如何變化及氮添加與磷組分之間影響關系的研究還不夠深入。土壤磷的分級可以進一步提供土壤中磷的遷移和有效性的信息[22]，由此我們提出兩個科學假設：(1)在氮添加條件下，高寒草甸土壤的活性磷組分含量會顯著增加；(2)氮添加會通過降低土壤pH值促進土壤無機磷的溶解，還會通過增加微生物活性和磷酸酶活性促進土壤有機磷的礦化，從而增加土壤中磷的生物有效性。

綜上所述，本研究以青藏高原高寒草甸為研究對象，通過在野外定位試驗平臺上實施氮添加的試驗處理，將土壤中的磷按照有效程度進行分級，探究土壤磷組分在氮添加下的變化特征，并進一步探究氮添加下土壤的理化性質和生物特性與土壤磷組分之間的關系，深入理解氮添加條件下高寒草甸生態系統土壤特性對土壤磷轉化特征的影響，為探究青藏高原高寒草甸可持續管理利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

養分添加試驗地位于青海省海晏縣西海鎮(36°92′ N,100°93′ E)，依托青海省海北州高原現代生態畜牧業科技試驗示范園建立。海拔高度范圍在3 000～3 100 m，該地區離青海湖較近，為高原大陸性氣候，全年日照總長大約有2 580 h，特點是雨熱同期，夏季涼爽濕潤，冬季寒冷干旱。年平均降水有400 mm，主要集中在6—8月。年均溫為1.5℃，最高月均溫22.9℃，最低月均溫-24.8℃。試驗地的草地類型屬于高寒草甸草原，土壤為粘壤土，樣地中的主要植物種類有針茅(Stipaaliena)、賴草(Leymussecalinus)、洽草(Koeleriamacrantha)、冰草(Agropyroncristatum)、扁蓿豆(Melissitusruthenica)、矮嵩草(Kobresiahumilis)、星毛委陵菜(Potentillaacaulis)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)和冷蒿(Artemisiafrigida)。植物生長集中在6—9月，生長期較短，8月初為植物生長旺盛時期。

1.2 試驗設計

養分添加試驗樣地建立于2019年6月。其中，有三個氮添加水平，分別為5 g·m-2(N5)，10 g·m-2(N10)和15 g·m-2(N15)。一共3個氮添加處理，加上對照(CK)共4個處理，設置4個重復，總計16個小區。每個小區的大小為3 m×4 m，各小區之間設置1 m的間隔。養分添加的處理安排在每年草地的返青期(6月初)，氮添加以尿素(N含量46%)的形式每年施入一次。在試驗期間，樣地周圍有圍欄圍護，采用封閉管理。

1.3 取樣方法

在連續施肥兩年后的生長高峰期(2020年8月初),使用0.5 m×0.5 m的樣方取各小區的植物樣品，將樣方內的植物貼地刈割后烘干稱重，記作植物地上生物量(g ·m-2)。使用土鉆(直徑5 cm)在各小區內取0～10 cm的土樣，各小區重復取樣5次，充分混合后過粗篩(2 mm)，篩去根系和大塊土粒，分成2份，1份風干后常溫保存，用于測定土壤理化性質；1份儲存在-20℃冰箱，用于測定土壤無機氮、酶活性和微生物生物量。

1.4 試驗方法

植物樣品用硝酸-高氯酸消煮30 min后用比色法測定植物磷含量(g ·kg-1)，地上植物整株含磷量(g ·m-2)為植物磷含量乘以植物生物量。

土壤磷組分的測定用Tiessen改進后的Hedley磷分級方法提取土壤中的磷素[23-24]。稱取0.5 g的風干土壤至50 mL離心管中，分別用陰離子交換樹脂膜、0.5 mol ·L-1NaHCO3、0.1 mol ·L-1NaOH、1 mol ·L-1HCl、濃HCl進行連續浸提，最后用濃H2SO4和H2O2于360℃消煮至液體澄清。有研究將Hedley磷分級方法測出的磷組分進行了土壤磷庫的劃分[25-26]，將樹脂提取態無機磷(Resin-Pi)和碳酸氫鈉提取態無機磷(NaHCO3-Pi)劃分為活性磷(Labile P)，將氫氧化鈉提取態無機磷(NaOH-Pi)、氫氧化鈉提取態有機磷(NaOH-Po)和(1 mol ·L-1鹽酸提取態無機磷)1 mol ·L-1HCl-Pi劃分為中等有效磷(Moderately labile P)，將濃鹽酸提取態全磷(HCl conc.-Pt)和殘余態磷(Residual-P)劃分為穩定磷(Stable P)，磷庫的劃分可以幫助我們更加系統的認識到磷的有效性。

1.5 數據分析

利用Shapiro-Wilk檢驗數據是否符合正態分布(P>0.05)，單因素方差分析(One-Way ANOVA)用于分析土壤磷組分和土壤特性在氮添加下的變化，使用P<0.05的顯著性水平。通過SPSS 19.0軟件完成數據分析，繪圖由Origin 2019和R 4.0.2共同完成。Pearson相關分析用于比較土壤特性和土壤磷組分之間的相關性，通過R 4.0.2中的ggplot2包繪制相關分析熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同氮添加水平對土壤磷組分的影響

由圖1可知，與CK相比，N5和N10處理下的活性磷顯著增加了28.7%和43.8%；與CK相比，3個水平的氮添加都降低了土壤中等有效磷的含量，N5差異顯著(P<0.05)。穩定磷在N10和N15顯著降低18.0%和11.0%(P<0.05)；總磷在N10和N15顯著降低4.23%和5.86%(P<0.05)。

圖1 氮添加對土壤磷庫的影響Fig.1 Effects of N addition on soil P pool注：平均值±標準誤；不同小寫字母分別代表在0.05水平差異顯著，n=4，下同Note:Mean±SE. Different lowercases letters indicate the significant difference at the 0.05 level,n=4,the same as below

由圖2所示，相較于CK，土壤NaHCO3-Pi含量在N5中顯著提高了44.1%(P<0.05)；3個氮添加處理使土壤中HCl conc.-Pt的含量均有不同程度降低，N5和N10差異顯著(P<0.05)；N15處理下Residual-P的含量顯著降低了15.1%(P<0.05)；對于Resin-Pi，NaOH-Pi，NaOH-Po和1 mol ·L-1HCl-Pi，不同水平的氮添加對其含量都沒有顯著的影響。

圖2 氮添加對土壤磷組分的影響Fig.2 Effects of N addition on content of soil P fractions

由圖3所示，與CK相比，NaHCO3-Pi占總磷的比例在N5和N10處理下顯著提高了49.1%和36.9%(P<0.05)；Residual-P占總磷的比例在N10處理下顯著降低了18.5%(P<0.05)。此外，不同水平的氮添加處理相較于CK對Resin-Pi，NaOH-Pi，NaOH-Po，1 mol ·L-1HCl-Pi和HCl conc.-Pt所占總磷的比例都沒有顯著改變。

2.2 不同氮添加水平對土壤生物因素和非生物因素的影響

不同水平的氮添加對土壤ACP活性無顯著改變(圖4a)，ALP活性隨氮添加水平的上升有增加的趨勢但并不顯著。相較于CK，土壤MBC在N10和N15處理下顯著提高了12.1%和8.10%(P<0.05，圖4c)。土壤MBN在N10和N15處理下均顯著增加了17.9%和18.0%(P<0.05，圖4d)。

圖3 氮添加對土壤磷組分占總磷比例的影響Fig.3 Percentages of different P fractions in total P after N addition

表1 氮添加對土壤理化性質的影響Table 1 Responses of soil physicochemical properties to N addition

圖4 氮添加對土壤酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性(a)、 微生物生物量碳和微生物生物量氮(b)的影響Fig.4 Effect of N addition on acid phosphatase and alkaline phosphatase activity (a),microbial biomass carbon and microbial biomass nitrogen (b)

2.3 氮添加下植物生物量及地上部整株含磷量的變化

植物地上生物量隨著氮添加水平的增加而提高，N10和N15處理相較于CK顯著提高97.4%和151%(P<0.05，圖5a)。植物地上部磷含量在不同氮添加處理中都有所增加，N10和N15處理相較于CK顯著增加了0.07 g·m-2和0.06 g·m-2(P<0.05，圖5b)。

2.4 氮添加下影響土壤磷組分的關鍵因素

由圖6所示，土壤MBC和NaOH-Pi含量存在顯著正相關關系(P<0.05)；MBC和MBN均與Residual-P呈顯著負相關關系(P<0.05)；土壤pH值和1 mol ·L-1HCl-Pi、HCl conc.-Pt、Residual-P存在顯著正相關關系(P<0.05)；其他土壤因素和各磷組分含量之間均無顯著相關關系。

圖5 氮添加對植物地上生物量(a)和植物地上部整株磷含量(b)的影響Fig.5 Effect of N addition on the aboveground biomass of plants (a) and the shoot P content of plants (b)

圖6 氮添加處理下土壤因素和磷組分的相關性分析Fig.6 The correlations between the soil factors and P fractions after N addition.注：** 表示P<0.01，* 表示P<0.05。ALP，堿性磷酸酶；ACP，酸性磷酸酶；MBC，微生物生物量碳；MBN，微生物生物量氮;IN，無機氮；SOC，土壤有機碳Note:** indicate P<0.01,* indicates P<0.05. ALP,alkaline phosphatase activity,ACP,acid phosphatase activity,MBC,microbial biomass carbon,MBN,microbial biomass nitrogen,IN,inorganic nitrogen,SOC,soil organic carbon

3 討論

3.1 不同氮添加水平下土壤磷組分狀況

N5處理下土壤中有效磷組分的含量和比例增加，緩解土壤中的磷限制。在青藏高原亞高山生態系統的施氮試驗結果表明[27]，氮施入土壤會通過促進有機磷的周轉和釋放顯著增加有效磷的含量。氮添加會導致土壤發生一系列的變化從而增加植物磷吸收效率，植物會通過產生磷酸酶和釋放有機酸(如草酸、檸檬酸和蘋果酸)這兩種途徑進一步促進土壤磷的有效性[28]。在森林生態系統中的試驗也得到了相似的結果，氮添加通過降低鐵鋁氧化物含量減少了難分解和封閉的磷組分，同時增加了土壤的有效磷[29-30]。韓興國課題組[31]在內蒙古草原長期氮添加的試驗結果也表明，氮富集會通過土壤酸化活化草地中礦物結合態的磷，從而增加土壤中有效磷的含量。

本研究中，N15處理下，由于地上生物量和植物含磷量的增加，土壤活性磷的含量和比例在N15處理下均沒有顯著變化，同時穩定態磷和總磷含量均顯著下降。對草地生態系統原位氮添加試驗進行的meta分析結果表明，氮添加會顯著降低土壤全磷的含量[32]。有草地生態系統的研究得出，土壤全磷含量在兩年的氮添加處理下顯著下降[33]。這是由于在氮添加條件下地上凈初級生產力增加，對土壤有效磷的需求也提高，土壤的中等有效磷庫和穩定磷庫向有效磷轉化并被地上植物吸收利用，這導致了土壤中磷的消耗。也有研究通過相關分析可以得出，土壤磷庫含量降低與地上總生物量的積累存在比例關系[28]。在半干旱草原添加尿素的試驗結果得出，氮的輸入促進了難溶性磷轉化為中等有效磷，從而提高了植物對磷的吸收，這歸因于較高的植物生產力[29]。

3.2 氮添加下調控土壤磷組分的重要生物因素

本研究采用土壤磷酸酶活性、微生物量碳和氮代表土壤生物因素。其中，土壤磷酸酶根據對環境酸堿度的適應分為酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)[35]，本研究選取的試驗地為石灰性土壤，由ALP主導土壤磷的礦化過程。在不同水平的氮添加下，土壤ALP活性存在上升的趨勢，土壤ACP活性沒有顯著改變。氮添加下土壤磷酸酶活性提高的原因可以歸結為土壤微生物在分泌胞外酶時，由于外源氮輸入滿足了微生物對氮元素的需求，微生物為維護氮磷養分平衡，會將能量集中生產磷酸酶以獲取土壤中的有效磷[36]。還有一個原因是，磷酸酶所含氮含量較高，在氮添加條件下，微生物獲取足夠的氮才能供應磷酸酶的分泌過程[37]。在草原生態系統長期的施氮試驗中也得到了相似的結果[38]，在氮輸入增加的情況下，土壤磷酸酶活性增加。氮沉降可以顯著增加溫帶森林土壤的MBN和MBC含量[39]，與本研究結果一致，土壤MBC含量在氮添加處理下顯著增加。這與高寒草甸速效養分缺乏有關，由于氣溫較低，土壤中氮的有效性還是不足以滿足植物和微生物的需求，氮的添加為微生物提供了必要的營養元素，因此土壤中的MBC和MBN增加。

氮添加下土壤微生物生物量的增加，這可能有利于微生物固定土壤中的有效磷[40]，但同時土壤微生物也可以參與有機磷礦化和無機磷溶解過程[41]。土壤中的微生物也參與調節土壤中磷組分的轉化，氮添加下土壤MBN和MBC與Residual-P均存在顯著負相關關系，說明微生物也促進了穩定磷向有效磷的轉化。此外，氮添加下土壤MBC與NaOH-Pi存在顯著正相關關系，說明微生物也在一定程度上促進了穩定磷向中等有效磷的轉化。

3.3 氮添加下調控土壤磷組分的關鍵非生物因素

土壤pH值是衡量土壤狀況的重要非生物因素，會受到氮添加水平的影響。本研究結果表明向土壤中施加氮會顯著降低土壤的pH值。可能的原因是由于氮在土壤中的硝化作用，硝酸鹽的淋溶產生的質子超過鹽基陽離子消耗的質子，這會導致土壤酸化[42]。在森林生態系統的研究中，森林生態系統下表層(0～10 cm)土壤pH值在氮添加下也出現了顯著降低[29]。還有研究解釋是，氮添加提高了微生物生物量，土壤微生物可以產生有機酸，從而降低了土壤pH值[43]。

土壤pH值降低可以減少石灰性土壤中的交換性鈣和鎂[44]，從而促使土壤中的無機磷溶解成為有效磷。相較于土壤有機磷，土壤無機磷的溶解過程受土壤pH值的影響較大[45]。在本研究中，土壤pH值在氮添加下顯著降低，并與穩定磷組分呈顯著正相關關系。以上結果說明，土壤酸化會增強土壤穩定磷組分向土壤活性磷組分的轉化，氮添加可以通過促進土壤難溶性磷組分的溶解而增加土壤磷的有效性。除此以外，土壤pH值還會通過影響土壤微生物進一步影響土壤磷有效性。已知土壤pH值是影響微生物多樣性的關鍵因素，通過改變土壤微生物細胞的pH值穩態來調節土壤養分的有效性[46]。有研究認為土壤中的ALP完全來源于土壤微生物[47]，因此，土壤pH值的變化會通過影響微生物的群落結構從而影響土壤中磷酸酶，進而影響土壤磷組分。

4 結論

由于地上植物對磷的吸收，高寒草甸土壤磷組分對不同水平氮添加的響應不一致。土壤pH值是影響青藏高原高寒草甸堿性土壤磷組分周轉的關鍵非生物因素，氮添加通過降低土壤pH值促進穩定磷的溶解，并通過增加土壤微生物生物量促進土壤穩定磷的活化。本研究結果表明，氮添加通過改變土壤pH值和微生物生物量增加了土壤活性磷組分，促進了植物對磷的吸收。