海南天然飼草青貯飼料中乳酸菌分離鑒定及優良菌株篩選

劉 悅， 字學娟*, 陳 婷， 孫 蓉， 李 茂， 湯 凱

(1. 海南大學林學院， 海南 儋州 571737; 2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所， 海南 儋州 571737； 3. 中國熱帶農業科學院湛江試驗站， 海南 湛江 524000； 4.海南大學食品學院， 海南 海口 570228)

微生物活動是青貯發酵的本質，原料表面附著微生物多樣性、菌種的生理生化特性以及外界環境等因素均能影響青貯發酵品質[1]。因此，調控微生物群落結構是保證青貯發酵品質的重要舉措之一。一般來說，乳酸菌作為優勢菌群的青貯發酵容易成功，通過產生乳酸和一些抗真菌代謝產物，可起到改善青貯飼料品質的作用[2]。

當前，研究人員發現通過篩選并添加不同種類的乳酸菌來可提高青貯成功率[3]，韋慶旭等[4](陜西)從構樹青貯飼料、玉米青貯飼料中分離出植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)4種可飼用菌種；張玉琳等[5](新疆)從雜交構樹(Broussonetiapapyrifera)青貯飼料中最終分離得到植物乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、糞腸球菌和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，此外，李榮榮等[6](北京)從紫花苜蓿自然青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌，能夠有效促進乳酸發酵、抑制梭菌生長、顯著改善高水分苜蓿青貯品質。Peng等[7](貴州)收獲包括紫羅蘭、高粱、玉米等12種青貯原料進行青貯，篩選得到的優勢菌株布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)添加到青貯飼料中有效地改善了溫暖潮濕氣候區紫花苜蓿青貯飼料的發酵質量；Wang等[8]從青藏高原普通野豌豆、高羊茅和多年生黑麥草中分離得到的植物乳桿菌和商業植物乳桿菌MTD—1對比，發現在10℃和15℃的低溫環境下，3種菌均可不同程度的改善意大利黑麥草青貯發酵品質。此外，Liu等[9]研究發現與商用植物乳桿菌菌株相比，篩選得到的菌株戊糖片球菌在20℃下對改善柱花草青貯品質最為有效。因此，不同區域不同飼草附著乳酸菌種類和特性差異較大，從不同來源分離鑒定和篩選本土優良乳酸菌菌株具有重要意義。

在全球變暖的背景下，日均最高氣溫≥40℃的天數也在增加。高溫是熱帶地區影響青貯品質的重要環境因素，高溫會增加青貯飼料pH值和干物質損失，降低其乳酸含量和有氧穩定性，極大的影響飼用價值[10]。乳酸菌特性在熱帶和溫帶有明顯差異[10]，商品化乳酸菌制劑不能很好地適應熱帶的氣候，發揮預期效果[11]。海南島為熱帶季風氣候，夏季長達6個月(月平均溫度≥30℃)且無冬季，而天然飼草青貯飼料中乳酸菌的分離及鑒定鮮有報道，因此，本研究以分布廣泛、可用作飼草為標準選取海南島的野生草本植物斑茅(Saccharumarundinaceum)、蔓生莠竹(Microstegiumvagans)和木本植物銀合歡(Leucaenaleucocephala)、構樹(Broussonetiapapyrifera)為材料，并在5個氣候區東部濕熱區、西部干旱區、南部暖潮濕區、北部半濕熱區、中部山地潮濕區采樣對比，篩選高溫條件下適合熱帶牧草的優良乳酸菌菌株，旨在豐富對我國熱帶地區乳酸菌菌群多樣性認知和促進熱帶飼草青貯添加劑的研發。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑及儀器

供青貯的原料為從海口(110°11′E，19°54′N，年均溫24.1℃，年均降水量1 788 mm，海拔160 m)、瓊中(109°34′E，19°1′N，年均溫22.4℃，年均降水量2 350 mm，海拔560 m)、萬寧(110°25′E，18°54′N，年均溫23.9℃，年均降水量2 420 mm，海拔30 m)、三亞(109°34′ E，18°19′ N，年均溫26.9℃，年均降水量1 716 mm，海拔40 m)、昌江(108°58′ E，19°19′ N，年均溫24.6℃，年均降水量1 680 mm，海拔90 m)、儋州(109°30′ E，19°30′ N，年均溫23.8℃，年均降水量1 870 mm，海拔160 m)野外采集的草本植物斑茅、蔓生莠竹和木本植物銀合歡、構樹。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Es-cherichiacoli)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)來自海南大學食品科學與工程學院實驗室。

De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)瓊脂培養基、De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)肉湯培養基：購自杭州百思生物技術有限責任公司；細菌微量生化反應管：購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1青貯制備 將采集得到的飼草切碎至2～3 cm，自然晾曬24 h后裝入聚乙烯青貯袋中，每袋200 g，每個處理重復3次。用抽真空包裝機抽真空后密封，于室內35℃～40℃環境下儲存發酵60 d。

1.2.2菌體分離及菌種純化 將青貯樣品按草：水=1:10比例浸泡在錐形瓶中，然后進行梯度稀釋，選取3個適宜梯度，各吸100 μL涂布于MRS固體培養基(含1.5% CaCO3)上，于37℃恒溫培養箱下厭氧培養48 h后，觀察菌落形態[12]等，挑取溶鈣圈明顯且較大的單菌落，于MRS固體培養基劃線3～4次，保存于—80℃超低溫冰箱，同時進行革蘭氏染色、過氧化氫酶檢驗。

1.2.3優勢菌MRS液體培養基初篩 將純化后的乳酸菌菌液濃度調至108cfu·mL-1搖勻接100 uL至裝有MRS液體培養基的離心管，放置在37℃恒溫培養箱中培養8，16，36 h后測定發酵液的pH值。測600 nm處OD(Optical density,吸光度)值，選取pH≤4且OD≥2[13]的菌株為初篩代表菌株。

1.2.4高溫條件下MRS液體培養基優勢菌復篩及耐酸能力測定 按初篩同樣的方法接100 ul至裝有MRS液體培養基的離心管，分別置于40，45，50℃培養箱中培養72 h，測發酵液600 nm處OD值。同上述方法再將乳酸菌接入pH為3.0，3.5，4.0，6.0，8.0，9.0的MRS液體培養基中培養3天后，測發酵液600 nm處OD值。

1.2.5測序及系統發育樹的構建 篩選所得優勢菌株進行16S rDNA測序(華大基因)，在NCBI數據庫搜索并選擇序列同源性較高菌株16S rRNA基因序列，采用MEGA7軟件構建系統發育樹，建樹方法為鄰接法(Neighbor-joining，NJ)[14]。

1.2.6生理生化試驗 采用細菌微量生化反應管，嚴格按照說明書操作，接菌方法為從MRS平板挑取單菌落到生化管，封口，放置于恒溫培養箱[15]。

1.2.7乳酸菌的生長曲線和產酸曲線的測定 將復篩后選出的優良乳酸菌稀釋定菌數(按上述方法)并接種置于37℃恒溫培養，在0—24 h每隔2 h取出1批樣品于600 nm處分別測定MRS培養基的OD值，同時用pH測定儀測定MRS培養基的pH值[16]，分別用來表征乳酸菌的生長速率和產酸速率。

1.2.8抑菌能力的測定 將指示菌株的活化劃線于營養瓊脂培養基，37℃恒溫培養48 h。挑取單菌落接種于營養肉湯培養基中，37℃，180 r·min-1條件下培養24 h。調整菌體濃度為1×107cfu·mL-1作為指示菌懸液；以1%(V∶V)的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養基中，37℃條件下靜置培養12 h，10 000 r·min-1離心2 min后取上清液，4℃保存作為上清液備用；利用牛津杯法測定抑菌性能，首先傾注15 mL將2%營養瓊脂培養基(滅菌)于培養皿，待水平靜置凝固后，打入100 μL指示菌菌液，涂布均勻后備用，均勻放置牛津杯垂直于培養基表面，在其中加入乳酸菌上清液100 μL，4℃擴散2 h后再37℃培養24 h。根據抑菌圈直徑大小來判斷結果[17]。

1.2.9數據分析 基礎數據用Excel 2019處理，用Oringin 2018軟件作圖，用MEGA 7繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從青貯樣品中分離得到127株乳酸菌，98株菌株革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫觸酶試驗均為陰性，初步鑒定為乳酸菌。

2.2 乳酸菌的產酸能力和生長能力初篩

就產酸能力而言，發酵36 h后，98株菌株中，pH≤4的有39株，占比為39.8%，其中，產酸能力最強的1株菌pH為3.91，以上菌株在8 h和16 h時也表現較好，8 h時39株中有一半以上pH≤5，而16 h時pH又進一步下降，39株中有95%左右pH≤4.5；此外，發酵36 h時，4

在生長能力方面，30.77%的菌株8 h時OD≥2，所有菌株均OD≥0.5；發酵36 h時，pH≤4的菌株同時滿足OD≥2。以36 h的pH≤4且OD≥2為條件，篩選得到39株優勢菌，同時以8 h和16 h的結果為參考，發現所選菌株均滿足生命力強且產酸能力強的要求。

2.3 乳酸菌的耐高溫能力和耐酸能力復篩

對初篩優勢菌39株進行耐高溫能力和耐酸能力復篩，以T=50℃條件下的生長情況為依據，以T=40℃和T=45℃時的OD值為參考，選出OD值最大的15株為復篩優勢菌，去掉測序結果中重復的菌種，最終得到4株優勢菌，并對其進行耐酸能力的實驗。隨著溫度的上升，所有菌株的OD值都呈現下降的趨勢，在T=50℃時，菌株10D，13C，15B的OD值為1.72，菌株14B的OD值為1.77；以pH=6為界，pH值越小則越抑制乳酸菌的生長，這種抑制作用在pH=3時最為明顯，僅14B的OD≥0.5，10D，13C，15B的OD分別為0.39，0.38，0.4。(表1)。

2.4 優良乳酸菌的生理生化、16S rDNA序列分析、系統發育樹、生長速率及產酸速率和抑菌效果

從表2中可以看出，所選菌株能利用廣泛的糖源，但利用種類和能力有差別。所有的菌株七葉苷和苦杏仁苷生化管反應都呈陽性，七葉苷水解試驗陽性說明該乳酸菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素；苦杏仁苷陽性則說明該該乳酸菌含β-葡萄糖苷酶可催化苦杏仁苷水解為兩分子葡萄糖和1分子杏仁腈；另外，所有的菌株都能利用纖維二糖、葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蕈糖、蔗糖、鼠李糖、木糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖，但利用能力不一，其中，15B對乳糖的利用能力較弱；14B對蜜二糖的利用能力較弱；13C，14B，15B對甘露醇的利用能力較弱；14B，15B則對L-阿拉伯糖的利用能力較弱；10D，15B對木糖和屬李糖的利用能力較弱；10D，13C，14B對半乳糖的利用能力較弱；然而，所有的菌株都不能利用山梨醇、淀粉且硝酸鹽反應呈陰性，說明所選菌株不含硝酸還原酶和淀粉水解酶；10D不能利用棉子糖、甘露醇。

表1 4株優勢菌株耐受性實驗結果Table 1 Tolerance of four representative strains to acid and high temperature

表2 4株優勢菌株生理生化實驗結果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of four representative strains

將代表菌株進行16S rDNA測序后，將序列結果提交至NCBI數據庫對相似性進行比對，結果見表3。菌株10D和植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarumstrain Heal19)同源性最高，菌株13C和植物乳桿菌(LactobacillusplantarumSN13T)同源性最高，菌株14B和植物乳桿(Lactiplantibacillusplantarumstrain 202195) 同源性最高，菌株15B和乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticistrain CACC 537)同源性最高，所有菌種的同源性和標準菌株序列覆蓋率均達到100%，E值都為0。E值代表在隨機狀態時，目標序列與其他序列的相似度大于本條序列的可能性。表中所列E值均為0，說明比對結果可靠。

表3 4株優勢菌株的16S rDNA序列同源性比對結果Table 3 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from four typical isolates

表4可知，4株代表菌株抑菌效果均較明顯，表現在其對所有致病菌抑菌圈的直徑均大于10 mm。其中10D和13C對大腸桿菌的抑制作用更強；13C對金黃色葡萄球菌的抑制效果更好；10D對沙門氏菌的抑制作用較好；菌株10D，14B和15B對單核細胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑大小較為接近且數值較高，說明對該致病菌有更強的抑制能力。

表4 4株優勢菌株的抑菌能力Table 4 Antibacterial activity of four representative strains

圖1所示，4株優勢菌株呈現出相似的生長情況，0～2 h菌株生長緩慢，處于遲滯期；2 h后迅速生長繁殖，進入對數生長期；到10 h后，生長速率減緩；22 h后趨于穩定，基本不再生長，曲線趨向“S”型。在對數期，相比其他菌種，菌株13C長勢較快，菌株15B在2～4 h相對平緩；在穩定期，菌株13C生長情況最好，其余菌株長勢相似。

圖1 在MRS肉湯培養基中培養的4株乳酸菌于600 nm 處的光密度值Fig.1 The optical density values at 600 nm of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

圖2所示，菌株10D培養2～12 h產酸速率較快，12～24 h產酸效率減小；菌株13C和14B在2～6 h時pH迅速下降，在6～24 h時pH有所下降但幅度變小；菌株15B在2～8 h時產酸速率較快，8～22 h產酸效率減小，22 h時趨于穩定期，pH值基本保持不變。在產酸速率上，菌株13C較其他菌株更快；在產酸能力上，菌株10D最強。

圖2 4株乳酸菌于MRS肉湯培養基中培養的 pH值變化Fig.2 The pH values of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

由圖3可知，菌株10D，13C，14B與植物乳桿菌(GenBank登錄號：MT229370.1)和植物乳桿菌HBUAS52250(GenBank登錄號MH472975.1)聚于一枝，親緣關系最近，故將這3株菌株鑒定為植物乳桿菌。由圖4可知，菌株15B與乳酸片球菌(GenBank登錄號MW425291.1)聚于一枝，親緣關系最近，因此，將其鑒定為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。

圖3 利用16S rDNA序列對植物乳桿菌進行構建系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree for Lactobacillus plantarum based on their 16S rDNA sequences

圖4 利用16S rDNA序列對乳酸片球菌進行構建 系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree for Pediococcus acidilactici based on its16S rDNA sequence

3 討論

青貯發酵的微觀層面是由飼草表面附著微生物的活動所主導的[18]，其中，乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)等在青貯飼料發酵中起關鍵作用[19]。乳酸菌的迅速繁殖會使得發酵體系中的pH值迅速下降，抑制大部分好氧細菌、大腸桿菌和霉菌等不利于青貯發酵的微生物繁殖[20]，使得發酵品質更佳。因此，從青貯飼料中篩選優良乳酸菌對改善青貯發酵品質具有重要意義。

本研究以不同氣候區以及草本、木本飼草為微生物富集材料，為分離純化更豐富的菌株提供了基礎。有學者總結，在青貯中若要作為添加劑使用，乳酸菌需具備兩個條件1)耐酸能力強，活性高，生長迅速；同時大量產酸，迅速使得pH≤4，其它微生物的生長因此而受到抑制；2)除了乳糖外，可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖等，最好可以發酵戊糖[21]。從初篩結果和生理生化實驗結果來看，大部分乳酸菌在MRS液體培養基中培養36 h，培養液的pH≥4，這表明這些菌株的產酸能力較低，自然青貯難以取得良好效果，而優勢菌10D，13C，14B和15B 在2 h即進入對數生長期，在36 h時pH降至4.0以下，且均可發酵多種糖源，因此，所選優勢菌株都有潛力作為乳酸菌添加劑來改善青貯發酵品質。篩選到的優勢菌10D，13C，14B和15B比付浩等[22]從玉米青貯飼料中篩選得到的短乳桿菌和戊糖片球菌(12～20 h為對數生長期)生長更快，但其優勢菌株36 h左右pH達到3.6，最終的產酸能力較本實驗所篩的優勢菌稍強。

此外，青貯微生物受溫度影響比較大，熱帶的高溫環境會影響細菌細胞酶的活性，從而影響其生長代謝。而生活在這種環境中的菌株，會改變生理生化特性以達到適應環境的目的，形成特定的氣候生態型。本研究旨在分離純化出適應熱帶氣候的優勢乳酸菌，使本土優良菌種種質資源得以合理利用。因此在復篩時采用T=50℃下的生長情況較好(OD值高)為篩選原則，得到了4株耐高溫同時耐酸能力良好的優勢菌株，此前，研究人員從貴州省[7]青貯飼料中篩選得到的布氏乳桿菌(L.buchneri)和西南高溫高濕地區[10]青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)在pH=3.5和T=45℃的條件下均可生長，對高溫和酸性環境具有良好的適應性。從蘭州市[23]玉米秸稈和白菜尾菜混貯料中分離純化得到的12株乳酸菌可以在pH=4.5和T=45℃條件下生長。而本實驗分離純化得到的乳酸菌對高溫脅迫的耐受性更強，能在50℃的環境下生長繁殖。

對微生物的16S rDNA序列進行分析可以達到初步分類鑒定的目的，基于其構建的系統進化樹可以確定菌種在進化中的位置。一般認為，在種分類水平上，2個分類單位間16S rDNA序列同源性高于97.5%則屬于同一個種。經16S rDNA測序，結合糖發酵結果，10D，13C，14B為植物乳桿菌，15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。其中，植物乳桿菌被發現可以從多種飼草中篩選得到，新鮮仙人掌植物和青貯飼料中最常見的乳酸菌是植物乳桿菌(65%)[24]；Li等[25]從玉米秸稈青貯飼料中分離出的植物乳桿菌ZZU 203和204具有抗菌活性，可用作青貯添加劑，以抑制青貯過程中不良微生物的增殖并保存青貯飼料的營養；袁潔等[26]從自然青貯多花黑麥草中篩選出的優質菌株中80%為植物乳桿菌。乳酸菌可以通過產生大量的有機酸、過氧化氫等物質來抑制致病菌的生長，是否具有抑菌作用和抑菌作用的強弱是評價乳酸菌的重要內容。結果顯示4株菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑均大于10 mm，具有很強的抑制作用，說明從青貯飼料分離的這4株乳酸菌對常見病原菌具有抑制作用。

4 結論

本研究從海南島不同地區不同植物樣本中共分離到98株乳酸菌，經過初篩和復篩，得到4株優勢菌株并進行16S rDNA測序。經鑒定，10D，13C，14B為植物乳桿菌，15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)，4株代表菌株中，菌株13C長勢較好且產酸速率較快，菌株10D產酸能力較強。耐受性試驗中，菌株14B在pH=3.0環境下生長較好，耐酸能力較好；所有菌株在50℃環境下生長良好，耐高溫能力強，在抑菌試驗中，所選優勢菌株均可有效抑制致病菌的生長，其中，菌株10D可以有效的抑制大腸桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌，菌株13C則對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用。