結(jié)直腸癌中MMR蛋白表達與MSI的一致性分析

藍 洋，劉 鋒，葛 佳，鄧 慶，李 磊，李愛玲，韋 森，羅 韜

微衛(wèi)星(microsatellite，MS)是由單核苷酸(A)n、二核苷酸(CA)n或多核苷酸組成的短的串聯(lián)重復(fù)序列[1]。在DNA復(fù)制過程中，串聯(lián)重復(fù)區(qū)域易發(fā)生DNA復(fù)制錯誤造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)。錯配修復(fù)(mismatch repair, MMR)蛋白可以修復(fù)新生鏈中復(fù)制錯誤的序列[2-4]，參與MMR系統(tǒng)的主要基因有MSH2、MSH6、MSH3和MLH1、PMS2、PMS1、MLH3[3-6]；參與消化道腫瘤相關(guān)的MMR基因主要為MSH2、MSH6、MLH1和PMS2。MSI已在結(jié)直腸、胃、子宮內(nèi)膜、卵巢等多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)[7-9]。2017年美國食品和藥物管理局(FDA)批準了pembrolizumab用于治療成人和兒童不可切除的或轉(zhuǎn)移性的微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(mismatch repair-high, MSI-H)或MMR缺陷(defective MMR, dMMR)的實體瘤患者。本文選擇MSI發(fā)生頻率較高的結(jié)直腸癌作為研究樣本，對免疫組化和一代測序結(jié)果進行比較，分析2種方法檢測的一致性，以提高臨床與病理醫(yī)師的認識水平。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年6月～2020年12月陸軍軍醫(yī)大學(xué)/第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院同時行MMR蛋白檢測和一代測序檢測MSI的結(jié)直腸癌樣本74例，其中男性38例，女性36例，年齡25～83歲，平均60歲。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法檢測MSH2、MSH6、MLH1和PMS2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達。標本經(jīng)常規(guī)處理，切片，60 ℃烤箱烘烤3 h，脫蠟、水化，EDTA高壓修復(fù)3 min，冷卻至室溫，3%H2O2避光浸泡10 min，PBS漂洗3次；37 ℃一抗孵育60 min，PBS漂洗3次；37 ℃二抗孵育30 min，PBS漂洗3次，DAB顯色；蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，流水充分沖洗返藍，梯度乙醇脫水，環(huán)保透明劑透明，中性樹膠封固。

1.2.2一代測序 使用上海源奇公司生產(chǎn)的MSI檢測試劑盒對腫瘤組織及癌旁組織進行檢測，該試劑盒覆蓋5個MS位點(BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250)。

1.2.3二代測序(next generation sequencing, NGS) 使用QIAGEN DNA提取試劑盒提取腫瘤組織和癌旁組織的DNA。使用南京世和公司425基因探針靶向富集DNA。使用illumina NextSeq 550Dx對終文庫進行測序。分別使用bcl2fastq、Trimmomatic、BWA、Picard對數(shù)據(jù)進行拆分、去接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)、比對基因組、去重等操作。最后使用GATK進行突變篩選和分析。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1免疫組化結(jié)果判讀 由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行綜合判斷，其中“+”為MMR正常(pMMR)，“-”為dMMR。

1.3.2一代測序結(jié)果判讀 本組檢測5個MS位點，與對照相比≥2個位點改變判定為MSI-H；1個位點改變判定為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定(mismatch repair-low, MSI-L)；5個位點均沒改變判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stable, MSS)。

1.3.3NGS結(jié)果判讀 MSI檢測panel設(shè)計74個MS位點，其中MSI位點占總MS位點13%以上判定為MSI-H。MMR基因突變檢測結(jié)果通過IGV進行復(fù)核。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)直腸癌MSI狀態(tài)、MMR蛋白表達與臨床病理特征分析采用χ2檢驗，其中M分期采用Fisher檢驗。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中MMR蛋白表達和MSI檢測結(jié)果74例結(jié)直腸癌患者中，pMMR有57例；dMMR有17例，其中2例(11.76%)MSH2和MSH6缺失，1例(5.88%)MSH6缺失，12例(70.59%)MLH1和PMS2缺失，1例(5.88%)PMS2缺失，1例(5.88%)MLH1、PMS2和MSH2缺失。MSI檢測結(jié)果顯示：74例患者中MSS有58例，MSI-H有15例，MSI-L有1例。

2.2 結(jié)直腸癌中MMR蛋白表達、MSI狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系比較MMR蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，原發(fā)腫瘤T1+T2期患者的dMMR發(fā)生率高于T3+T4期(P<0.05，表1)。本組將MSI-L與MSS歸為一組統(tǒng)計分析MSI與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，≤60歲患者的MSI-H發(fā)生率高于>60歲患者(P<0.05)；原發(fā)腫瘤T1+T2期患者的MSI-H發(fā)生率高于T3+T4期(P<0.05)；N0期患者的MSI-H發(fā)生率高于N1+N2+N3(P<0.05，表2)。

表1 結(jié)直腸癌中MRR蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表2 結(jié)直腸癌中MSI狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 NGS檢測分析將免疫組化和一代測序檢測結(jié)果不一致的2例進行NGS檢測。例1 MS位點共覆蓋73個，其中MSI位點5個(圖1)，MSI位點/總MS位點為6.85%，MS狀態(tài)為MSS，且該例未檢出MMR基因突變。例2 MS位點共覆蓋69個，其中MSI位點1個(圖2)，MSI位點/總MS位點為1.45%，MS狀態(tài)為MSS，且未檢出MMR基因突變。

圖1 例1發(fā)生MSI位點的片段化圖示

圖2 例2發(fā)生MSI位點的片段化圖示

2.4 MMR蛋白檢測與MSI檢測的一致性分析MMR蛋白檢測和MSI檢測結(jié)果相符合的有72例，符合率為97.30%，2例不符合樣本免疫組化結(jié)果均為dMMR，一代測序結(jié)果均為MSS。例1 MSH2、MLH1和PMS2蛋白表達缺失，一代測序結(jié)果為MSS，NGS結(jié)果為MSS且MMR基因未發(fā)生突變。例2 MLH1蛋白表達缺失，一代測序結(jié)果為MSS，NGS結(jié)果為MSS且MMR基因未發(fā)生突變。對2例免疫組化結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)：例1 MSH2、MLH1和PMS2的陽性對照均為陰性，且腫瘤細胞區(qū)域可見部分陽性細胞(圖3)；例2 MLH1的陽性對照為弱陽性，且腫瘤細胞區(qū)域可見部分陽性細胞(圖4)。

圖3 例1：A.MSH2的陽性對照，細胞核呈陰性，EnVision兩步法；B.MSH2的腫瘤陽性區(qū)域，細胞核呈局部陽性，EnVision兩步法 圖4 例2：A.MLH1的陽性對照，細胞核呈弱陽性，EnVision兩步法；B.MLH1的腫瘤陽性區(qū)域，細胞核呈局部陽性，EnVision兩步法

3 討論

MMR基因的突變或甲基化均可引起蛋白功能的缺失，最終導(dǎo)致MSI的發(fā)生。MMR蛋白表達與MSI相關(guān)，免疫組化法檢測MMR蛋白表達與一代測序檢測MSI的一致性較高[10]。除免疫組化和一代測序這兩種檢測方法外，NGS是檢測MSI的另外一種有效方法，該方法的原理是計數(shù)對應(yīng)MS位點堿基對的長度并對長度百分比進行定量評估[11]。

本組通過對結(jié)直腸癌患者免疫組化結(jié)果與一代測序結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，MSI-H與患者年齡、T分期以及N分期相關(guān)，在較年輕、T1+T2期、N0期患者中MSI-H的發(fā)生率較高。MLH1蛋白缺失通常伴隨著PMS2蛋白缺失，MSH2蛋白缺失通常伴隨著MSH6蛋白缺失，但PMS2或MSH6蛋白缺失可以單獨發(fā)生，與文獻研究結(jié)果一致[10]。在MSI-H患者中有超過一半的患者發(fā)生MLH1和PMS2蛋白缺失。

綜上所述，MSI-H常見于年輕、低級別患者中，且發(fā)生MLH1和PMS2蛋白缺失的頻率較高。免疫組化檢測MMR蛋白缺失與一代測序檢測MSI的一致性較高，但免疫組化檢測受到抗體試劑、實驗操作影響較大，其結(jié)果判讀對病理醫(yī)師的要求較高；而一代測序?qū)嶒灧€(wěn)定性較高、結(jié)果判讀標準相對明確。與一代測序相比，免疫組化成本低、可以直接找出MMR缺陷基因。NGS的優(yōu)點在于可以檢測更多MS位點來評估MSI，可同時檢測MMR基因以及結(jié)果判讀不受醫(yī)師經(jīng)驗的限制；缺點在于NGS檢測方法panel眾多且沒有標準的計算方法和統(tǒng)一的標準。因此建議首先通過免疫組化檢測PMS2、MLH1、PMS2和MSH6蛋白表達，對免疫組化檢測有疑問的樣本進行一代測序檢測驗證。需注意的是，結(jié)直腸癌中MSH6蛋白表達可能會存在異質(zhì)性缺失的情況[12]，為保證結(jié)果的準確需行一代測序進行驗證。在經(jīng)濟條件允許的情況下，可以選擇包含MSI、KRAS、NRAS、BRAF以及MMR基因的panel，并且選擇白細胞作為對照可同時進行林奇綜合征篩選。