齊墩果酸聯合5氟尿嘧啶通過調控JNK信號通路影響肝癌細胞中鈣離子的表達

董 靜，王 玉，陳 萍，呂艷欣，李鵬輝，張 嵩，任曉旭，劉雅楠

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，全球每年肝癌新增確診病例多達84萬[1]。近年來，雖然肝癌的治療已取得了重大進展，但肝癌患者的病死率仍較高[2-3]。目前，天然抗腫瘤藥物在臨床應用中受到了廣泛關注[4]。齊墩果酸(oleanolic acid, OA)是從女貞子、白花蛇舌草等中藥材中提取的五環三萜類化合物，可增強化療藥物的敏感性，因此在癌癥的預防和治療方面具有獨特潛力[5-6]。其與5氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5FU)協同對肝癌細胞中Ca2+表達水平及JNK通路影響的分子機制尚未明確。因此，本實驗在前期研究基礎上進一步探討肝癌細胞中OA/5FU協同用藥前、后Ca2+表達變化及其與JNK信號通路的相關性，為天然藥物的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 肝癌細胞株BEL-7402購于中國科學院動物研究所(中國北京)細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 OA(SO8030)、5FU(IF0170)購自北京索萊寶公司；Mag-fluo-4 Ca2+指示劑(美國Thermo Fisher Scientific公司，M14206)；Rhod-2AM Ca2+熒光探針(英國Abcam公司，ab142780)；山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司，ZB-2305)；SP600125(美國Med Chem Express公司，HY-12041)。

1.1.3儀器 IX83倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；5200型化學發光成像系統(上海天能公司)；全自動680酶標儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和分組 將細胞在含10%胎牛血清的培養基中培養。根據前期實驗基礎將細胞分為空白組、OA/5FU協同組(OA 100 μmol/L、5FU 40 μmol/L)、抑制劑組(SP600125 10 μmol/L)、抑制劑+OA/5FU協同組(SP600125 10 μmol/L、OA 100 μmol/L、5FU 40 μmol/L)。

1.2.2MTT法測定細胞活力 將細胞按照5 000個/孔接種在96孔板中，置于CO2培養箱中。給藥24、48和72 h后，將20 μL MTT(5 mg/mL)加入各孔中，孵育4 h。將200 μL DMSO加入各孔中10 min。利用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.2.3集落形成實驗 將單細胞懸浮液按200個/孔鋪在6孔板中，孵育14天。4%多聚甲醛將細胞固定15 min。Giemsa染色30 min。拍攝菌落圖像，并計數。

1.2.4胞質和線粒體Ca2+水平檢測 24孔板中的BEL-7402細胞經藥物處理后，分別加入500 μL線粒體Ca2+熒光探針Rhod-2AM和胞質Ca2+熒光探針Mag-fluo-4，37 ℃避光孵育30 min。D-Hanks液洗滌后每孔加入DMEM培養液，熒光顯微鏡檢測胞質和線粒體中Ca2+水平。同時收集經藥物處理的細胞，分別加入1 000 μL的Rhod-2AM和Mag-fluo-4，避光孵育30 min。收集細胞，洗滌后使用流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.5免疫熒光實驗 細胞在4%多聚甲醛中固定10 min。使用0.3%Triton X-100封閉1 h。將Grp75抗體稀釋于1%BSA/PBS/0.3%Triton X-100中，加入到細胞中4 ℃孵育過夜。將細胞與熒光染料標記的二抗室溫下孵育1 h。DAPI復染，使用熒光顯微鏡檢測信號。

1.2.6Hoechst 33342染色 將單細胞懸浮液按200個/孔鋪在6孔板中，給藥后各孔加入4%多聚甲醛1 mL，10 min后棄固定液。各孔分別加入Hoechst 33342染液1 mL(濃度為10 mg/L)室溫作用30 min。洗滌后在熒光顯微鏡下拍照。

1.2.7Western blot分析 蛋白質裂解，冰上孵育30 min。4 ℃、15 000 r/min離心，收集上清液。分離蛋白質樣品并轉移到PVDF膜。將膜封閉2 h后與一抗4 ℃孵育過夜。用TBST將膜洗滌3次。將膜與結合HRP的二抗在室溫下孵育2 h。使用熒光成像系統對結果進行定量分析。

2 結果

2.1 OA/5FU協同對肝癌細胞活力的影響與空白組比較，OA/5FU協同顯著降低了體外肝癌細胞的生存活力(P<0.05)；在JNK通路抑制劑SP600125作用下，OA/5FU協同對體外肝癌細胞的生存活力有顯著抑制作用(P<0.05，圖1)。

圖1 OA/5FU協同對肝癌細胞細胞活力的影響：*P<0.05

2.2 OA/5FU協同對肝癌細胞集落形成能力的影響與空白組比較，OA/5FU協同顯著降低了肝癌細胞的集落形成能力(P<0.01)。在JNK通路抑制劑SP600125作用下，OA/5FU協同使肝癌細胞集落形成能力下降，抑制了肝癌細胞增殖(P<0.01，圖2)。

圖2 集落形成實驗檢測OA/5FU協同對肝癌細胞增殖的影響：與空白組相比，**P<0.01

2.3 OA/5FU協同對肝癌細胞中Ca2+水平的影響通過線粒體Ca2+熒光探針Rhod-2AM和胞質Ca2+熒光探針Mag-fluo-4檢測肝癌細胞中Ca2+水平，并通過流式細胞術分析Ca2+熒光強度。結果表明：與空白組相比，OA/5FU協同可增加肝癌細胞中Ca2+的表達；在JNK通路抑制劑SP600125作用下，OA/5FU協同促進肝癌細胞內Ca2+的釋放且作用顯著(圖3)。提示OA/5FU協同可能是通過調控JNK信號通路影響肝癌細胞中Ca2+的表達水平。

圖3 OA/5FU協同對肝癌細胞中Ca2+水平的影響

2.4 OA/5FU協同對Ca2+通道Grp75蛋白的影響通過免疫熒光染色檢測Ca2+通道相關蛋白Grp75的表達情況。結果表明，Grp75蛋白主要位于細胞質，在JNK通路抑制劑的影響下，OA/5FU協同可顯著降低Grp75的表達(圖4)。

圖4 肝癌細胞中Ca2+通道相關蛋白Grp75的IF染色：藍色表示DAPI，綠色表示Grp75

2.5 OA/5FU協同對肝癌細胞凋亡的影響與空白組比較，OA/5FU協同可誘導肝癌細胞發生凋亡。在JNK通路抑制劑SP600125作用下，OA/5FU協同對肝癌細胞凋亡有明顯誘導作用(圖5)。

圖5 OA/5FU協同對BEL-7402肝癌細胞凋亡的影響

2.6 OA/5FU協同對肝癌細胞中Ca2+通道相關蛋白和JNK通路相關蛋白表達的影響與空白組比較，OA/5FU協同降低了Grp75和PDI、BCL-2蛋白表達，而VDAC1、Bax和cl-Caspase3蛋白表達明顯增多。上述結果提示，在JNK通路抑制劑SP600125作用下，OA/5FU協同可調控Ca2+通道相關蛋白的表達并通過調控JNK通路誘導細胞凋亡(圖6)。

圖6 Western blot檢測OA/5FU協同對Ca2+通道相關蛋白和JNK通路相關蛋白的影響：與空白組相比，**P<0.01

3 討論

OA是最常見的五環三萜化合物之一，主要存在于女貞子、白花蛇舌草等草本植物中，是一種著名的2期異種生物轉化酶誘導劑。OA能有效地預防肝癌、胰腺癌和肺癌等多種疾病，因此受到廣泛關注[7]。大量研究表明，聯合用藥可以提高抗癌藥物的療效并降低抗癌藥物的細胞毒性。例如，在肝癌細胞中OA與常規化療藥物索拉非尼協同處理可誘導DNA片段和Caspase-3/7裂解[8]；瑞格非尼片與OA聯合可以進一步增強抗EMT的作用[9]。上述研究提示，OA可能具有調節腫瘤細胞敏感性的作用，具有成為增敏劑的潛力[10]。

JNK是MAPK家族成員之一，在DNA損傷修復、細胞自噬及細胞的增殖、凋亡中都起著重要的調控作用，其功能失調被認為與多種疾病的發病機制關系密切[11]。目前研究已證實，JNK信號通路可調控肝癌細胞周期及細胞凋亡。如肝癌耐藥細胞中JNK1、JNK2及JNK3活性與肝癌細胞耐藥程度呈負相關[12]。另外，激活JNK可使BCL-2磷酸化致使其活性受抑制，激活線粒體途徑的主要介導者Bax，使細胞色素C等促凋亡線粒體蛋白釋放至胞質內從而形成線粒體Ca2+內流和細胞色素C外流的交換通道，使下游Caspases活化啟動凋亡通路。相反，在一定的刺激因素下JNK通路被抑制，BCL-2等抗凋亡活性蛋白失去了JNK磷酸化的激活，同樣會加速細胞凋亡的發生。

近年來，腫瘤的形成過程與Ca2+生物學功能的研究逐漸成為熱點。Messenger等[13]報道細胞內Ca2+升高對腫瘤的發生和轉移至關重要。Flourakis等[14]也報道前列腺癌中Ca2+水平失調，并與TRPM8(冷感應)蛋白高表達有關，Ca2+信號傳導在細胞增殖中發揮重要作用。Ca2+通道1,4,5-三磷酸肌醇受體作為細胞內唯一的鈣釋放通道，在其作用下Ca2+信號廣泛參與基因表達、細胞分化等生理功能[15]。本實驗中OA/5FU協同影響肝癌細胞中Ca2+水平，并影響著細胞凋亡相關蛋白的表達。上述結果提示，OA/5FU協同可能是通過調控Ca2+表達水平誘導細胞凋亡。

Ca2+信號在內質網和線粒體的聯系中發揮關鍵作用，如參與脂質運輸、能量代謝，對細胞存活率也有影響。兩種細胞器之間的作用依賴于互補的膜蛋白，如電壓陰離子通道VDAC1等。線粒體外膜的VDAC1與內質網的IP3R受體通過綁定Grp75、PDI等分子伴侶調控Ca2+從內質網轉移到線粒體[16]。本實驗發現，OA/5FU協同可以調控肝癌細胞中Ca2+通道相關蛋白Grp75和VDAC1的表達。此外，最近有研究發現抑制BCL-2能調控內質網與線粒體之間Ca2+通信，參與調節腫瘤細胞的藥物敏感性[17-18]。

綜上所述，OA/5FU協同通過調控JNK信號通路影響肝癌細胞內Ca2+的表達水平，可誘導細胞凋亡。但OA/5FU協同是否調節Ca2+通道開關及其調控JNK信號通路抑制肝癌細胞增殖的具體分子機制還需要進一步確認。OA/5FU協同對Ca2+水平的影響可能成為肝癌潛在的治療方向，為臨床治療提供一些可供選擇的策略。