攜帶BRCA基因致病性變異的膽道癌3例臨床病理及分子遺傳學特征

顧怡瑾，李安琪，董 磊，謝嘉玲，袁 菲，王朝夫

膽道癌(biliary tract cancer, BTC)是一組具有高度異質性的惡性上皮性腫瘤[1]。對常規放、化療不敏感，中位總生存期(median overall survival, mOS)約12個月[2]。隨著高通量測序技術的發展，揭示了膽道癌的高頻基因變異如TP53、KRAS和SMAD4等在疾病發病機制中的關鍵作用[3]。國外研究發現，有3.6%的BTC可檢測到乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene, BRCA)變異[4]，但國內尚缺乏相關報道。本實驗室在開展膽道癌高通量測序研究中發現3例攜帶BRCA基因致病性變異的膽道癌(BRCA-mutant biliary tract cancers, BRCA-mutant BTC)，探討其臨床病理及分子病理學特征，有助于認識其在臨床治療上的價值。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年5月～2022年1月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院病理科經高通量測序檢測的BTC 19例，經生物信息分析篩選出3例BRCA-mutant BTC，并對患者進行隨訪，末次隨訪時間2022年5月19日。

1.2 方法

1.2.1高通量測序檢測 采用QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取3例樣本腫瘤組織的石蠟基因組DNA，使用燃石生物公司OncoScreen Plus Panel檢測試劑盒制備文庫。通過NextSeq4 000(Illumina)平臺對基因組DNA文庫進行測序。

1.2.2基因組變異的生物信息分析解讀 根據國內外相關指南及共識[5-6]，對3例BTC進行Ⅰ類(有較強臨床重要性的變異)和Ⅱ類(有潛在臨床重要性的變異)解讀。

1.2.3Sanger測序驗證 采用QIAGEN QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取2例樣本的外周血基因組DNA，并針對檢測到的BRCA基因致病變異位點分別進行引物序列設計[7]，以相應DNA為模板進行PCR擴增及測序。測序結果與基因庫BRCA基因參考序列比對。

2 結果

2.1 臨床病理特征19例BTC行高通量測序并經生物信息分析解讀，檢出3例BRCA基因致病性變異，確診為BRCA-mutant BTC。3例BRCA-mutant BTC中，例1、2為手術切除標本，例1腫瘤位于膽囊底部，例2腫瘤侵及膽管壁及部分膽囊壁，切面均灰白色，質中；例3腫瘤位于肝門部膽管，送檢為穿刺組織。3例組織學類型均為腺癌，例1(圖1)及例2組織學分級均為中分化，例2伴膽管旁及膽囊周圍淋巴結轉移。相關臨床病理、治療及隨訪預后情況詳見表1。家庭史：例1患者姐姐和例2患者父親患有胰腺癌。

表1 3例BRCA-mutant BTC的臨床病理特征及隨訪

圖1 例1腫瘤組織HE染色：腺癌，中分化，細胞核增大，核仁突出，核分裂象增多

2.2 分子病理特征3例BRCA-mutant BTC分別檢出1例BRCA1和2例BRCA2基因致病性變異，均為截斷突變，例1及例2的腫瘤組織及外周血樣本經Sanger測序驗證，均為胚系變異(圖2)。同時，均檢出TP53基因不同位點的Ⅱ類變異。另例2還攜帶ARID1A、CDKN2A、FBXW7基因變異，例3攜帶PDGFRA基因拷貝數擴增。腫瘤變異負荷(tumor mutation burden, TMB)值為5.98～12.96 Mut/Mb，均為腫瘤微衛星穩定(microsatellite stable, MSS)(表2)。

表2 3例BRCA-mutant BTC的高通量測序

圖2 A.例1腫瘤組織測序BRCA2基因c.2095C>T導致p.Gln699*；B.例1外周血樣本測序基因變異同腫瘤組織

2.3 隨訪例1患者行化療，隨訪8個月，健在；例2患者行免疫治療聯合靶向治療，隨訪34個月，因BTC伴肝腹水死亡；例3患者行化療，隨訪37個月，因肝衰竭及BTC伴多部位淋巴結轉移死亡。

3 討論

BRCA基因的致病性變異與乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的發生密切相關，同時還是PARP抑制劑治療相關的生物學標志物[8]。Golan等[9]在研究膽管癌臨床特征時發現攜帶BRCA2基因致病變異的人群患BTC的風險增加，Hirosawa等[10]提出BRCA-1相關蛋白(BAP1)缺失會導致細胞侵襲。因此，BRCA-mutant BTC是BTC的特殊分子亞型。目前，PARP抑制劑已運用于攜帶BRCA基因變異的轉移性胰腺癌患者，延長其無進展生存期，療效獲得肯定[11]。然而，其能否運用于BTC中值得探究。

本組對19例BTC進行高通量測序發現3例BRCA-mutant BTC。由于樣本量較小，國內尚未見報道，故本文針對這一分子亞型進行國外文獻復習(表3)。國外研究者已在BTC中發現此分子亞型的胚系及體系變異，并已提出BRCA基因變異會影響BTC的DNA損傷修復[12]，與BTC易感性相關[13]，PARP抑制劑可能使此類患者得到更多的治療選擇。

表3 BRCA-mutant BTC國外文獻匯總

本組對3例BRCA-mutant BTC進行總結，例2和例3患者均已為中晚期。臨床對3例患者分別進行了不同的治療方式，例2和例3分別采用靶向治療聯合免疫治療和化療，兩者的總生存期差異不明顯(34個月和37個月)。因此對于中晚期BTC患者，建議盡早進行高通量測序，尋找有效靶向基因。

BRCA-mutant BTC的胚系變異與體細胞變異有不同的側重點。胚系變異側重于遺傳疾病的致病性，會顯著增加BRCA基因相關腫瘤的發病風險；體細胞變異側重于對靶向藥物敏感性的判斷[5]。因此，明確BRCA-mutant BTC患者胚系或體細胞變異的臨床及分子遺傳學特征非常重要，在檢測出腫瘤BRCA致病性變異后，應對患者的外周血或咽拭子樣本進行采樣，以進行更好的胚系遺傳評估。本文對例1和例2的腫瘤及外周血樣本進行Sanger測序驗證，均檢出BRCA基因變異，證實2例均為胚系變異。結合這2例患者均有一級親屬患胰腺癌的家族遺傳史，而胰腺癌患者的BRCA基因變異率為0～17%[14]。因此，具有BRCA基因胚系變異BTC患者，提示直系親屬患BRCA基因相關腫瘤的發病風險會增高，應對其直系親屬進行遺傳咨詢及篩查，告知上述風險使其能提早預防。

本組3例BRCA-mutant BTC患者均檢出TP53基因變異，并提示了微衛星狀態和TMB值。Valle等[15]發現BTC的TP53變異率為40%～59%，患者總生存期時間短，提示其變異是腫瘤發生及患者生存的高風險因素。Goeppert等[16]發現只有1.3%的BTC患者為高頻微衛星不穩定。TMB閾值目前在BTC的不同研究中均有差異[17-18]。因此，本組3例BRCA-mutant BTC微衛星狀態及TMB值尚不足以為臨床治療提供依據。

綜上所述，采用高通量測序技術檢測到BRCA-mutant BTC這一少見的BTC分子亞型，提示對于中晚期BTC患者基因檢測可以為臨床治療提供新方向。同時，區分胚系或體細胞BRCA基因變異對BRCA-mutant BTC尤為重要。