非小細胞肺癌中EGFR、ALK、ROS1基因突變和PD-L1表達及臨床意義

伍錦鳳，何 杰

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率均位居所有惡性腫瘤之首[1-2]，其中NSCLC占肺癌的80%～85%[3]。近年隨著腫瘤驅動基因和免疫靶點的深入研究，腫瘤靶向治療及免疫治療已廣泛應用于臨床，它們具有特異性高、不良反應輕等特征，其中EGFR、ALK、ROS1作為肺癌的驅動基因是靶向治療的重要靶點，EGFR基因突變狀態可以指導EGFR-TKI的治療[4]；ALK及ROS1基因融合狀態可以指導ALK/ROS1抑制劑的治療[5]；PD-L1是免疫治療重要的預測標志物，目前已有多項研究證實，在惡性腫瘤的治療中阻斷PD-1/PD-L1通路的免疫治療療效顯著[6]，PD-L1陽性NSCLC患者對PD-1單抗(PD-L1抑制劑)有更高的總體緩解率，這些靶向藥物及免疫治療的藥物也相繼被CFDA批準進入醫保，減輕了患者負擔。本文對84例NSCLC分別行EGFR、ALK、ROS1、PD-L1檢測，分析EGFR/ALK/ROS1基因突變狀態和PD-L1蛋白表達及與臨床病理特征的關系，并探討在NSCLC靶向治療及預后評估中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集安徽省腫瘤醫院2018年1月～2019年12月存檔的84例NSCLC手術標本，其中男性54例，女性30例，年齡36～83歲，中位年齡66歲，吸煙者39例，非吸煙者45例，患者術前均未接受其他治療。所有病例切片均由2位高年資病理醫師重新復診，最終確診腺癌71例，鱗狀細胞癌13例。

1.2 方法

1.2.1突變擴增阻止系統(amplification refractory mutation system, AMRS) EGFR基因突變檢測試劑盒(包含18、19、20、21外顯子29個位點突變，武漢友芝友生物公司)配制試劑，提取DNA，DNA稀釋濃度為10～15 ng/μL，逆轉錄，ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增，主要程序：37 ℃ 10 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，40個循環；60 ℃ 60 s(采集熒光)40個循環。反應結束后計算ΔCt值并進行結果判讀。所有試驗均設陰、陽性對照。

1.2.2FISH 標本4～5 μm厚切片，65 ℃烤箱內過夜，置于全自動FISH前處理系統儀(武漢康錄生物公司)中，進行脫蠟、酶解消化；滴加ALK及ROS1基因融合檢測熒光原位雜交探針(武漢康錄生物公司)，置入Hydridizer原位雜交儀(丹麥，DAKO公司)中雜交2 h，復染DAPI后置于OLYMPAS BX53熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3二代測序(next generation sequencing, NGS) 石蠟組織DNA提取試劑盒(磁珠法)(華大基因)提取石蠟樣本的基因組DNA，DNA濃度>5 ng/μL，采用EGFR-KRAS-ALK基因突變聯合檢測試劑盒(華大基因)構建DNA測序文庫，并采用特定的探針捕獲目標DNA片段，BGI MGISEQ 2000測序平臺(華大基因)進行測序，讀長為PE100，測序深度>500×，將得到的原始數據進行過濾并行生物信息學分析。

1.2.4免疫組化 組織標本4 μm厚切片，在Autostainer link 48免疫組化儀中預熱的低pH抗原修復液97 ℃孵育20 min，一抗PD-L1(22C3)室溫孵育30 min，小鼠LINKER室溫孵育30 min，HRP室溫孵育30 min，DAB顯色及增強后蘇木精復染，顯微鏡下觀察。所有試驗均設陰、陽性對照。PD-L1結果判讀依據TPS診斷標準：腫瘤比例評分是指部分或完整膜染色的腫瘤細胞占樣本中所有活腫瘤細胞的百分比，TPS=染色陽性腫瘤細胞數/總活腫瘤細胞數×100%，TPS<1%為不表達，TPS 1%～49%為低表達，TPS≥50%為高表達。

1.3 統計學分析采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，應用χ2檢驗列聯表對數據進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC中EGFR、ALK及ROS1基因突變與臨床病理特征的相關性84例NSCLC中，45例EGFR突變，突變率為53.6%，突變類型：19Del占33.3%，21L858R占46.7%，21L861Q占4.44%，20ins占6.67%，其余類型占8.89%，包括19Del與20T790M、20T790M和21L858R、18G719和19Del、18G719和21L858R雙突變各1例。敏感突變占88.9%，包括19Del、21L858R、21L861Q和18G719；原發耐藥突變占11.1%，包括20T790M和20ins(圖1)。EGFR突變與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤病理類型以及腫瘤分化程度有關(P<0.05)，與淋巴結轉移及臨床分期無關(P>0.05，表1)。84例NSCLC中，2例ALK融合陽性，占2.38%；1例ROS1融合陽性，占1.19%；2例ALK重排陽性，均發生于高分化腺癌，1例ROS1重排陽性發生于中～低分化腺癌(圖2)。EGFR突變和ALK或ROS1重排具有排他性，未見同時顯現。

表1 EGFR突變、PD-L1蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系

圖1 NSCLC中EGFR基因突變類型及突變率：EGFR基因突變類型為21L858R占46.7%，19Del占33.3%，21L861Q占4.44%，20ins占6.67%，其余類型占8.89%

圖2 NSCLC中ALK、ROS1基因融合情況：A.可見紅綠信號分開距離大于2個信號點的距離，示ALK陽性；B.可見紅綠信號沒有分離及未見單個紅色信號，示ALK陰性；C.可見紅綠信號分開大于2個信號點的距離及單個綠色信號點，示ROS1陽性；D.可見紅綠信號沒有分離及未見單個綠色信號，ROS1基因融合陰性

2.2 PD-L1蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的相關性84例NSCLC中，PD-L1不表達38例(45.2%)，低表達23例(27.4%)，高表達23例(27.4%)(圖3)。PD-L1表達與腫瘤病理類型有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及臨床分期均無關(P>0.05，表1)。

圖3 NSCLC中PD-L1蛋白表達情況

2.3 NSCLC中PD-L1蛋白表達與EGFR、ALK、ROS1基因突變的相關性84例NSCLC中，EGFR突變45例，ALK重排2例，ROS1重排1例。分析PD-L1蛋白表達與三者之間的相關性，發現PD-L1蛋白表達與EGFR、ALK、ROS1基因突變情況均無關(P>0.05，表2)。

表2 PD-L1蛋白表達與EGFR、ALK、ROS1基因突變的相關性

3 討論

EGFR常見的突變位點包括18、19、20及21外顯子，EGFR-TKIs(如吉非替尼、厄洛替尼等)靶向藥物有顯著療效，外顯子20(T790M、INS)突變可引起TKIs的耐藥[7]，L861Q、G719X、S768I等其它突變類型患者對EGFR-TKI的反應性低于19Del和L858R突變患者，突變率較低，且常常傾向于以聯合突變的形式存在[8]，因此準確評估EGFR的突變狀態尤為重要。本文兩組經典突變19Del和21L858R突變占80.0%(36/45)，與以往研究結果一致；其它突變包括20T790M、21L861Q、20ins和18G719僅占20%(9/45)，其中耐藥突變占11.1%(5/45)，包括20T790M和20ins。進一步分析EGFR基因與臨床病理特征的相關性發現，女性患者的突變率高于男性患者，年齡<60歲患者的突變率較高，非吸煙患者的突變率較高，病理類型為腺癌的突變率高，高分化腫瘤的突變率比中、低分化腫瘤的突變率高。探討基因突變與臨床病理特征的關系可以評估突變狀態，篩選適合基因檢測的患者。本組結果顯示：年輕、不吸煙的女性高分化腺癌患者的總體突變率較高，應作為基因檢測及靶向治療的重點篩查對象。

ALK和ROS1基因融合是除EGFR外兩個明確的NSCLC驅動基因，ALK和ROS1基因融合患者使用克唑替尼、阿來替尼等靶向藥物可取得較好的療效。NCCN指南建議對腺癌、大細胞癌和組織學無法確定類型的NSCLC以及非吸煙、活檢小標本或混合組織學類型的鱗狀細胞癌患者同時進行EGFR/ALK/ROS1基因檢測[9]。ALK是一種Ⅰ型膜糖蛋白，被認為是肺癌的主要致瘤驅動基因之一，ALK基因融合多見于年輕、非吸煙的NSCLC患者[10]，本組84例患者中檢測到2例ALK基因融合(2.38%)。在全球范圍內NSCLC中ROS1基因融合的發病率為1%～2%[11]，東亞人口的發病率略高，為2%～3%[12]，本組84例NSCLC中發現1例ROS1融合陽性，陽性率為1.19%，這與既往文獻報道較一致。另外本實驗發現，EGFR/ALK/ROS1基因突變具有排他性，未見三者突變的同時顯現，這與既往研究亦較一致。

PD-1是免疫球蛋白超家族1型跨膜糖蛋白，主要表達于活化的T細胞表面，其配體PD-L1廣泛表達于T細胞、B細胞、單核細胞及多種腫瘤細胞[13]，PD-1和PD-L1結合可導致淋巴細胞凋亡，此種免疫負調節致使腫瘤細胞免疫逃逸，最終導致腫瘤生長及擴散。免疫抑制劑能夠阻斷信號通路，降低免疫逃逸，加速腫瘤凋亡，從而達到消除腫瘤的目的。研究顯示NSCLC中PD-L1的陽性率為39.9%～53.1%[14]，本組PD-L1不表達占45.2%，低表達占27.4%，高表達占27.4%。同時本實驗發現PD-L1表達與腫瘤病理類型有關，鱗狀細胞癌患者不表達及低表達率比腺癌患者高；PD-L1表達與患者性別、年齡、是否吸煙及腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及臨床分期均無關。有研究顯示，NSCLC中EGFR野生型患者PD-L1的陽性率高于EGFR突變型患者[15]；另有研究顯示，EGFR突變型患者的PD-L1陽性率比野生型高[16]。本文分析EGFR/ALK/ROS1基因突變與PD-L1表達的相關性，結果顯示PD-L1蛋白表達與EGFR/ALK/ROS1突變均無關。目前，對于EGFR/ALK/ROS1基因突變狀態與PD-L1蛋白表達相關性的研究結果較多，呈正相關、負相關及無相關性的均有報道，因此大樣本多中心的研究尤為重要，四者聯合檢測可以為患者提供更加準確的治療方案，真正得益于靶向及免疫治療。