發酵菌糠微生物的篩選及分類鑒定

趙寅鋒 詹琳琳 楊茗涵 張 欣

（吉林農業科技學院生物與制藥工程學院 吉林·吉林 132101）

近年來，隨著我國工業帶動社會經濟的迅猛發展，各種工廠迅速崛起，多種生產殘渣大量堆積。菌糠是食用菌栽培過程中的副產物，其中含有豐富的纖維素、蛋白等[1-2]。菌糠的利用途徑并沒有被完全開發出來。本研究主要目的是篩選高效纖維素降解菌，提高菌糠的營養價值[3-4]。一方面能夠避免因處理方式不當造成的環境污染和資源浪費，另一方面能推動其在養殖業中的利用，緩解我國飼料原料供應不足的局面，從而提高菌糠的利用率。

1 材料與方法

菌糠：取自吉林農業科技學院食用菌生產基地。

菌株篩選：將采集到的菌糠加入液體發酵培養基中，在30℃下搖床培養3天。在滅菌30分鐘的超凈工作臺中進行實驗，樣品液稀釋濃度10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。稀釋完畢后，用移液器分別移取1mL濃度為10-7、10-8、10-9的稀釋液，用已滅菌的涂菌棒涂布于纖維素剛果紅培養基中。待菌落長勢較好時，接種于牛肉膏蛋白胨培養基或PDA培養基中進行劃線培養。

菌株的鑒定：對上述降解能力較高的菌株進行編號，觀察記錄菌株的生長狀況、菌落特征、形態和結構，并進行革蘭氏染色、芽孢染色實驗、半固體實驗、需氧性實驗、MR實驗、葡萄糖發酵實驗等生理生化實驗以及16S rNDA測序。

半固體培養基：牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、NaCl 2.5g、瓊脂2g、蒸餾水500mL。

需氧性培養基：蛋白胨1g、NaCl 2.5g、K2HPO41g、葡萄糖4g、瓊脂3g、蒸餾水500mL。

葡萄糖發酵培養基：蛋白胨1g、NaCl 2.5g、K2HPO41g、葡萄糖5g、瓊脂3.5g、1%溴百里酚藍水溶液1.5mL，蒸餾水500mL。

接觸酶培養基：蛋白胨5g、酵母膏2.5g、NaCl 5g、蒸餾水500mL。

淀粉水解培養基：牛肉膏5g、酵母膏2.5g、NaCl 2.5g、瓊脂7.5～10g、可溶淀粉10g、蒸餾水500mL，pH值7，制成平板。

明膠液化培養基：蛋白胨2.5g、明膠60g、蒸餾水500mL，pH值7.2～7.4。

M-R培養基：蛋白胨0.25g、葡萄糖0.25g、NaCl 0.025g、蒸餾水500mL，pH值7.0～7.2。

生長曲線的繪制：以空白培養液為對照組，在分光光度計上調零點，從零時開始，每隔2小時測定三角瓶培養液吸光度值，每次測定時以未接種的培養液為對照調零，測定波長600nm，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，制作在該條件下菌株的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選、鑒定

2.1.1 菌株的篩選結果

酶活力見表1，經篩選后，得到了3株分泌纖維素酶的菌株，分別編號為K-1～K-3。由表1可知，K-3菌株的相對酶活力最高，后續實驗選取K-3菌株為研究對象。

表1 各菌株相對酶活力的比較Table1 Comparison of Relative Enzyme Activity of Strains

2.1.2 菌株K-3的鑒定

K-3的單菌落菌株是圓形、白色、平坦的，并且表面光滑，易于接種。菌株為革蘭氏陽性桿菌，無孢子和鞭毛。細胞長度短，長時間保存有白色凸起物。下圖為K-3在數碼顯微鏡下的照片，表2為K-3生理生化反應的結果。

圖1 K-3的照片Figure1 Photo of K-3

2.1.3 產酶菌株生理生化反應實驗結果

由表2可知，K-3菌株與不動桿菌屬微生物近似，K-3菌株的葡萄糖發酵試驗和接觸酶試驗呈陽性，且淀粉水解試驗、芽孢染色試驗、半固體試驗均為陰性，是鮑曼不動桿菌的典型特征。

表2 菌株K-3的生理生化反應實驗結果Table2 Physiological and biochemical reaction results of strain K-3

2.1.4 分子生物學鑒定

將K-3菌株16S rDNA序列與NCBI數據庫，利用BLAST程序比對同源性，檢索同源性高的菌株，并且通過建立系統發育樹（見圖2）進行分析。結合微生物生理生化特性研究結果（見表2），初步鑒定菌株K-3為Acinetobacter baumannii[5]。

圖2 菌株K-3的16S rDNA系統發育樹Figure2 16SrDNA phylogenetic tree of strain K-3

2.2 K-3的生長曲線

由生長曲線（見圖3）可以看出，K-3在22h內完整地經歷了細菌生長發育周期，其中：0至5h為調整期、5至13h為對數期、13至19h為穩定期、19至22h為衰亡期，并且在13至18h達到菌體數量的最大值。

圖3 菌株K-3的生長曲線Figure3 Growth curve of strain K-3

3 結論

纖維素降解菌的來源非常廣泛，在適宜的條件下均能合成和分泌纖維素酶。與真菌相比較，細菌的生長速度更快，生長條件更寬松。本研究從菌糠中甄選出一株具有纖維素降解能力的細菌K-3，通過形態學觀察、生理生化實驗和16S rDNA基因序列的分析，初步鑒定其為鮑曼不動桿菌；并對其生長曲線進行測定。

菌糠資源產量大、成本低，是潛在的飼料資源，然而當前并沒有得到充分合理的利用。本試驗研究的順利完成，能夠推動其在養殖業中的應用，一方面緩解了我國飼料原料供應不足的局面，另一方面也可以減少環境污染，為未來實現菌糠資源的飼料化利用提供參考。