基于高通量技術對比分析南洲大曲與茅臺大曲的細菌多樣性

何猛超，羅家順，羅 軻，3，涂翠娥，張嬌嬌，胡景輝，韓興林

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；2.湖南南洲酒業有限公司，湖南南縣 413200；3.湖南中和生物科技有限公司，湖南益陽 413000；4.國家酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京 100015）

醬香型白酒作為中國傳統白酒之一，以醬香突出、濃郁豐滿、空杯留香持久的特點受到廣大消費者的青睞。醬香型白酒以高粱為原料，高溫大曲為糖化發酵劑經高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、三年陳釀等工藝釀造。高溫大曲又稱“細菌曲”，作為醬香型白酒特有的曲種，含有多種微生物以及豐富的酶系，是醬香型白酒發酵過程中微生物的主要來源，同時賦予醬香型白酒獨特的香氣和風味。酒曲質量的好壞很大程度上影響白酒的品質，由于不同地區、不同白酒企業使用的高溫大曲不同，導致生產的醬香型白酒品質各異。因此，研究高溫大曲的微生物群落結構，尤其是細菌群落結構，有利于調控醬香型高溫大曲的制曲工藝，對醬香型白酒的優質釀造具有深遠意義。

隨著現代技術的高速發展，高通量測序技術在白酒行業的運用十分廣泛，主要用于研究酒曲、釀造環境、酒醅等微生物多樣性。近年來，高通量技術在醬香型白酒行業的研究中逐漸普遍，利用高通量技術解析高溫大曲的微生物群落結構及功能，結合傳統可培養方式篩選、分離功能微生物，兩種技術的聯用能更好地解析高溫大曲的微生物多樣性，對深入研究高溫大曲中不同微生物的產酶、產香特性具有重要意義。

茅臺酒是我國醬香型白酒的典型代表，其使用的高溫大曲也是醬香型白酒行業公認的優質大曲。以茅臺大曲為對照，研究其他醬香型白酒企業的高溫大曲微生物群落結構，對比分析兩者的微生物差異性，將有助于企業調控制曲工藝，提升產品的品質。湖南南洲酒業有限公司，具有百年釀酒歷史，致力于以稻米、高粱、小麥為主要原料的湖南區域特色的酒類產品開發和產業化生產研究，釀造的醬香型白酒選用貴州茅臺地區生產的紅纓子糯高粱，采用“三高三長”醬酒釀制工藝，所釀酒體醬香突出，幽雅細膩，深受業界及消費者好評。目前，鮮有關于我公司南洲大曲的研究報道。

基于此，本研究運用高通量測序技術檢測南洲大曲和茅臺大曲的細菌多樣性，采用生物信息學分析方法對比研究南洲大曲與茅臺大曲之間的細菌群落結構差異。通過本研究為我公司醬香型大曲工藝的改良以及產品質量的提高提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

耗材：本實驗所用高溫大曲為南洲大曲以及茅臺大曲，由湖南南洲酒業有限公司提供。大曲微生物DNA試劑盒為Fast DNA?Spin Kit for Soil。

儀器：Illumina MiSeq 高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲微生物DNA的提取

采用Fast DNA? Spin Kit for Soil 試劑盒提取兩種大曲的總DNA，具體提取步驟參照試劑盒說明書。提取后的DNA 采用Nanodrop 進行定量，并通過1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量。檢測合格的樣品使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建。細菌使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴增V4 高變區。本測試在中國食品發酵工業研究院高通量測序平臺完成。

1.2.2 生物信息學分析

在序列充足的情況下，為了使分析結果質量更高，首先對測序得到的原始數據（Raw Data）進行過濾處理，得到有效數據（Clean Data），基于有效數據進 行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚 類分析。基于OTU 聚類結果，可對OTU 進行Alpha 多樣性分析，了解樣品內微生物群落的多樣性和豐富度。基于物種組成分析，得到相應的物種信息；Venn圖分析得到樣品間共有或獨有的物種數目。

2 結果與分析

2.1 兩種高溫大曲細菌群落Alpha 多樣性比較分析

通過質量初篩的原始數據進行質控、去噪、拼接、去嵌合體后的樣品的高質量序列量分別為茅臺大曲68679、南洲大曲67202。基于細菌OTU 數進行Alpha 多樣性指數分析以及豐度等級曲線分析如表1、圖1 所示。從表1 可以看出，兩個高溫大曲樣品的覆蓋率（Goods coverage）均高于0.99，說明測序結果具有較高可信度，能夠反映樣品的真實情況。

圖1 豐度等級曲線圖

一般，多樣性指數主要反映樣品內微生物群落的多樣性和豐富度。其中，Chao1 指數和Observed species 指數標示樣品細菌群落的豐富度，Chao1 指數和Observed species 指數越大，表明群落的豐富度越高。茅臺大曲的Chao1 指數和Ob-served species 指數分別為432.61、428.80，均高于南洲大曲（Chao1 指數421.28，Observed species 指數420.60），說明茅臺大曲樣品的細菌群落豐富度高（表1）。Simpson 指數、Shannon 指數用來反映樣品的物種多樣性，Shannon 指數/Simpson 指數值越高，表明群落的多樣性越高。就樣品的細菌多樣性來說，南洲大曲樣品的Simpson 指數（0.96）以及Shannon 指數（5.93）較高，表明南洲大曲樣品中細菌多樣性高。Pielou’s evenness 指數標示微生物群落的均勻性，南洲大曲樣品的細菌群落均勻性略高于茅臺大曲。

表1 兩種高溫大曲細菌群落Alpha多樣性指數比較分析結果

圖1 為兩個樣品的豐度等級曲線圖，該曲線可以直觀地反映群落中高豐度和稀有OTU 的數量。折線在橫軸上的長度反映了樣品在該豐度中的OTU 數；折線的平緩程度，反映了群落組成的均勻度，折線越平緩，則群落中各OTU 間的豐度差異越小，群落組成的均勻度越高，折線越陡峭，則均勻度越低。從圖1 可知，兩個高溫大曲樣品微生物群落組成均勻。

2.2 兩種大曲之間物種差異性分析

韋恩圖可以直觀反映不同樣品之間的共有物種和特有物種，茅臺大曲和南洲大曲兩個樣品的微生物物種差異性如圖2 所示。從圖2 可知，茅臺大曲和南洲大曲的細菌數分別為430、419，兩個高溫大曲之間共有的細菌數僅為86 個，說明兩者之間的細菌群落差異性較大，這可能與兩種大曲制曲的環境、氣候不同相關。

圖2 兩種高溫大曲的韋恩圖

2.3 兩種大曲之間細菌群落結構比較分析

2.3.1 兩種大曲的細菌門水平群落結構分析

為進一步比較兩種大曲之間細菌群落豐度上的差異，根據OTU 分析結果，對樣品數據在門和屬水平上進行分類學分析。選取在門水平上豐度排名前20 的微生物進行差異性分析，結果見圖3。從圖3 可知，茅臺大曲和南洲大曲中的優勢菌門均為Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）以及Cyanobacteria（藍藻菌門）。這與前人研究結果相似，趙馳等發現不同原料制成的高溫大曲均是以厚壁菌門和放線菌門為絕對優勢門；侯強川等發現湖北省堯治河高溫大曲以厚壁菌門、放線菌門、變形菌門作為優勢菌門；戴奕杰等發現醬香型白酒在高溫制曲、發酵釀酒兩個階段的優勢菌門均為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門4類。說明醬香型白酒的優勢菌門以上述4 類為主，但不同菌門的豐度不一致。本研究中南洲大曲和茅臺大曲就4 類優勢菌門而言，細菌的群落豐度存在差異。南洲大曲的放線菌門（8.36 %）豐度顯著低于茅臺大曲的放線菌門豐度（23.62 %），變形菌門豐度（30.66%）顯著高于茅臺大曲的變形菌門豐度（14.22%）。

圖3 基于門水平兩種高溫大曲的細菌相對豐度圖

2.3.2 兩種大曲的細菌屬水平群落結構分析

基于屬水平兩種大曲的細菌相對豐度圖如圖4所示。相對豐度較高的菌屬為（芽孢桿菌屬）、（乳球菌屬）、（糖多孢菌屬）、（克羅彭斯特菌屬）、（假諾卡氏菌屬）、（片球菌屬）、（魏斯氏菌屬）、（高溫放線菌屬）等。本文研究與前人研究結果相似，GAN等分析茅臺大曲的微生物群落組成和功能特征，發現優勢菌群為鏈孢桿菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、乳酸菌屬（）、糖多孢菌屬（）和枝芽孢菌屬（）等；JIANG 等采用高通量測序技術解析北方醬香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物多樣性，結果表明，6 個大曲樣品中主要細菌屬為乳酸菌（）、魏斯氏菌（）、芽孢桿菌（）、糖多孢菌（）等。從圖4 來看，（芽孢桿菌屬）在南洲大曲和茅臺大曲中是絕對優勢菌屬，相對豐度分別為24.03%、22.96%。研究表明，芽孢桿菌屬是醬香型白酒中的功能微生物，具有較強的酶分泌能力，能產生蛋白酶、纖維素酶、糖化酶等，還能生成醬香型白酒中的風味成分，如四甲基吡嗪等。在茅臺酒曲中為優勢菌屬的（乳球菌屬）19.13 %、（克羅彭斯特菌屬）7.00 %，在南洲大曲中的相對豐度僅為2.15 %和1.57 %。相反地，南洲大曲中相對豐度較高的（片球菌屬）9.18%、（魏斯氏菌屬）8.26%、（沙雷氏菌屬）4.54 %、（高溫放線菌屬）4.54 %等幾個菌屬在茅臺大曲中相對豐度較低，僅為0.85 %、0.20 %、0.27 %、0.15 %。上述結果顯示兩種大曲之間在細菌屬水平上存在較大差異，南洲大曲存在獨特的微生物群落結構。有報道顯示，克羅彭斯特菌屬在白酒發酵中有利于乙酸、乳酸、乙酸乙酯等風味的形成。魏斯氏菌屬作為乳酸菌的一類，具有生成乳酸，降低發酵體系pH 值的作用，在傳統發酵食品行業是至關重要的菌株。因此，通過對比茅臺大曲和南洲大曲細菌屬的差異，可為后續南洲大曲酒廠篩選功能微生物或強化大曲提供一定指導。

圖4 基于屬水平兩種高溫大曲的細菌相對豐度圖

3 結論

本研究采取高通量測序技術，以茅臺大曲為標尺對比分析了南洲大曲的細菌群落結構和多樣性。結果表明，Alpha多樣性指數中，茅臺大曲的細菌群落豐富度較高，南洲大曲的細菌群落多樣性較高。在細菌門水平，茅臺大曲和南洲大曲中的優勢菌門均為Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）以及Cyanobacteria（藍藻菌門）。南洲大曲的放線菌門（8.36 %）豐度顯著低于茅臺大曲的放線菌門豐度（23.62 %），變形菌門豐度（30.66 %）顯著高于茅臺大曲的變形菌門豐度（14.22%）；細菌屬水平，南洲大曲和茅臺大曲的絕對優勢菌屬均為（芽孢桿菌屬），但兩種大曲之間在細菌屬水平上存在較大差異，南洲大曲存在獨特的微生物群落結構，其優勢菌屬為（芽孢桿菌屬）、（片球菌屬）、（魏斯氏菌屬）、（沙雷氏菌屬）等。通過對比分析南洲大曲與茅臺大曲之間的細菌群落結構和多樣性差異，可為后續醬香型大曲工藝的改良以及產品質量的提高提供有益指導。