長鏈非編碼RNA在神經退行性疾病中作用機制的研究進展

武世萍,俞 坤,鞏盼盼,王滿俠

(蘭州大學第二醫院,中國甘肅 蘭州 730030)

隨著人類基因組計劃的完成,人們發現只有 不到5%的基因是由編碼序列組成的,而大部分基因缺乏編碼蛋白質所需的開放閱讀框(open reading frame,ORF),故不能翻譯為蛋白質[1]。一般情況下,根據轉錄本長度是否小于200個核苷酸,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)可分為短鏈非編碼RNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),短鏈非編碼RNA包含轉移RNA(transfer RNA,tRNA)、核糖體 RNA(ribosomal RNA,rRNA)等,主要在基因表達過程中發揮重要作用,而lncRNA是轉錄本長度大于200 nt的具有特定二級結構的ncRNA,多位于細胞核或胞質內[2]。由于此前認識不足,lncRNA一直被認為是基因轉錄過程中的“噪音”,其生物學價值未被重視。近10余年來,隨著芯片靈敏度和二代測序技術的提高,超過50 000個人類lncRNA基因組被發現,這引起了分子生物學領域的高度關注[3]?，F有研究發現,lncRNA與包括自身免疫性疾病、惡性腫瘤在內的多種人類疾病的發病機制相關[4～5]。神經退行性疾病(neurodegenerative diseases,NDDs)是一類以大腦和脊髓神經元細胞喪失為特征的疾病,包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、多發性硬化(multiple sclerosis,MS)及亨廷頓病(Huntington disease,HD)等[6]。在不同NDDs發生發展過程中,研究人員觀察到lncRNA似乎發揮著重要的調控功能[6～7]。本文將簡要介紹lncRNA起源、分類及可能的生物學功能,重點總結lncRNA在臨床常見NDDs中可能發揮的作用機制的研究進展,以期加深人們對lncRNA生物學作用和NDDs發病機制的認識,為其診斷及治療提供新思路。

1 lncRNA生物起源、分類及可能的作用機制

lncRNA的生物起源至今仍不清楚,大多數lncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ,pol Ⅱ)低效轉錄產生的,其處理過程與mRNA生成相似,也形成5′端帽結構和3′端多聚腺苷尾結構[8]。因lncRNA在哺乳動物中具有低序列保守性及快速進化的特點,故學者們對其起源提出如下假說:1)蛋白質編碼基因在復制過程中發生變形產生;2)由其他ncRNA基因的片段或全基因復制演化而來;3)通過從頭生成產生,如染色體重排;4)轉座因子(transposable elements,TEs)的插入[9]。近年的研究發現,lncRNA具有與mRNA不同的轉錄、加工、輸出和周轉方式,這可能與lncRNA的細胞命運和功能密切相關[8]。

lncRNA的分類依據目前仍存在爭議,業界認為應優先考慮轉錄產物的大小及定位,其次是功能[10]。根據lncRNA與蛋白質編碼基因的相對位置和轉錄模式,其可分為4種不同類型:基因間區長非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA)、內含子lncRNA、重疊lncRNA及雙向lncRNA[7,10]。對lncRNA分類的研究或許有助于其生物起源及生物學功能的理解。

研究發現,lncRNA通過與DNA、RNA和蛋白質相互作用,調節染色質的結構和功能以及編碼基因的轉錄,并可以影響核糖核酸的剪接、穩定性和翻譯[8]。其可能的作用方式有:1)與染色質修飾復合物相互作用,充當染色質修飾物的支架;2)與轉錄因子相互作用激發轉錄;3)作為響應信號特定地刺激或抑制轉錄;4)結合調控蛋白作為引導RNA,引導調控蛋白到特定位點進行染色質修飾;5)作為特定基因增強子和啟動子之間的橋梁,激活轉錄;6)其他,即作為RNA加工過程的調節因子等[8,11]。lncRNA調控機制繁雜,其生物學功能的識別是分子生物領域一大挑戰。

2 lncRNA與中樞神經系統

全基因組轉錄研究表明,約有40%的lncRNA基因在中樞神經系統(central nervous system,CNS)中特異表達,參與CNS的發育及病理過程[12]。CNS的發育是一個復雜且高度定型的過程,研究已證實,lncRNA從早期神經分化到晚期突觸發生都發揮了不可或缺的作用,包括神經胚層分化、神經元-膠質細胞命運決定、突觸發生、突觸可塑性和強度的構建等[12～14]。例如:內胚層相關lncRNA1(definitive endoderm-associated lncRNA1,DEANR1)通過積極調節內胚層因子FOXA2的表達可促進內胚層分化[14];轉移相關的肺腺癌轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是一種有助于神經軸突細化的lncRNA,可促進突觸發生相關基因的轉錄[13]。除此以外,研究人員還發現,lncRNA與CNS不同類型的病理過程密切相關,如腦血管病、神經精神障礙(neuropsychiatric disorder,NPD)、神經膠質瘤、NDDs等,意味著這些尚未被充分理解的轉錄本在CNS疾病中也具有重要作用[11,15～16]。下面將著重介紹lncRNA在NDDs中的研究進展。

3 lncRNA與神經退行性疾病

NDDs是大腦特定神經元群體及其聯系功能進行性喪失而引發的病理狀態,隨著人口老齡化的到來,其患病率呈逐年上升趨勢,盡管醫療技術的發展日新月異,但仍無有效治療措施,臨床治療主要以延緩疾病進展為主[11,17]。研究發現,lnc-RNA的異常表達或者基因突變與NDDs有一定關聯,研究兩者之間的關系對理解NDDs的發生發展具有重要意義,并有可能在未來為此類疾病的治療提供思路。表1是幾種臨床常見NDDs中主要失調的lncRNA及調節作用。

表1 常見神經退行性疾病中表達失調的lncRNATable 1 Dysregulated lncRNAs in common NDDs

3.1 lncRNA與阿爾茨海默病

AD是一種以細胞外β淀粉樣蛋白(amyloid β-peptide,Aβ)沉積、神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle,NFT)形成、神經元丟失、突觸性和營養不良性神經炎為病理特征的典型NDDs[18～19]。AD已成為老年人癡呆的最常見原因,也是致死的主要原因;據估計,到2050年,全球AD患者將達8 000萬之多,這將顯著增加社會負擔[18～19]。lncRNA在AD發生發展中的機制是近年研究的熱點,現已發現多種lncRNA參與調節Aβ沉積、神經炎癥、突觸功能衰竭、神經營養因子消耗等AD病理改變過程[18],其中研究最為深入的是lncRNA與Aβ異常沉積的關系。

Aβ斑塊的形成是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)被β位點APP裂解酶1(βsite APP cleaving enzyme 1,BACE1)和 γ-分泌酶連續蛋白水解切割的結果,BACE1的失調可引起Aβ過度產生,導致AD發生[18]。β位點APP裂解酶1反義RNA(β-site APP cleaving enzyme 1 antisense RNA,BACE1-AS)是11號染色體(11q23.3)上BACE1基因的反義轉錄本。研究發現,BACE1-AS在mRNA和蛋白質水平上調節BACE1的表達,BACE1-AS可與BACE1 mRNA配對形成RNA雙工,增強BACE1 mRNA穩定性,進而通過轉錄后前饋機制增強APP加工和毒性Aβ生成[19]。Liu等[20]發現,在AD患者及Aβ誘導的AD細胞模型中,BACE1-AS和BACE1 mRNA的表達較對照組均增加,BACE1-AS的沉默可使細胞中BACE1的表達在mRNA和蛋白質水平上顯著降低。Feng等[21]對88名AD患者和72名健康對照血漿中的4個lncRNA水平進行了測定,發現BACE1在AD患者組特異性升高(P=0.006),受試者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線提示,相較于其他lncRNA,BACE1為最佳候選者。而Fotuhi等[22]比較了45名AD患者和36名健康對照血漿中的BACE1-AS水平,發現AD患者組BACE1-AS水平與對照組并無顯著差異(P=0.41),這與上述Feng等[21]的研究結論并不一致,而且此研究還發現,AD患者BACE1-AS的水平與簡易精神狀態評價量表(mini-mental state examination,MMSE)評分高低有關,MMSE≥20的AD患者血漿BACE1-AS水平顯著降低,而 MMSE＜20的患者血漿BACE1-AS水平顯著高于對照組。以上研究提示,BACE1和BACE1-AS在血漿中穩定存在,是AD非常有潛力的生物標志物;但是,可能與病情進展、樣本量不足等因素相關,研究結果并未獲得良好的一致性,未來需要更多的臨床研究證實其臨床價值。

51A是一種由RNA聚合酶Ⅲ(polymerase Ⅲ,pol Ⅲ)轉錄的長度約300 nt的lncRNA,由人sortilin相關受體1(sortilin-related receptor 1,SORL1)基因的反義構型轉錄而來[23～24]。SORL1亦稱為LR11或SORLA,是低密度脂蛋白受體家族中一員,在神經元中大量特異性表達。AD患者腦脊液中SORL1的表達水平降低,SORL1表達的減少或缺失會影響APP的運輸及蛋白水解切割,促進神經毒性Aβ的產生[24]。研究發現,51A在大腦皮質中高表達,其通過與SORL1前mRNA的內含子配對結合,發生選擇性剪接(alternative splicing,AS)事件,導致典型SORL1蛋白產量減少和選擇性變體產量增加,引起APP加工受損和Aβ生成增加[25]。一項研究表明,散發性AD患者血漿51A的表達較健康對照組明顯上調(P＜0.001),提示這種lncRNA有作為AD生物標志物的可能價值;而且,該研究還發現其表達水平與MMSE評分呈負相關(P＜0.001),提示其與AD嚴重程度存在一定聯系[26]。

神經母細胞瘤分化標志物29(neuroblastoma differentiation marker 29,NDM29)也是一種由RNA pol Ⅲ轉錄的lncRNA,炎癥刺激可促使其表達增加,與年齡匹配的對照組相比,NDM29在AD患者的大腦皮質中表達增強,這表明NDM29與AD發病可能相關[19]。從機制上來說,高水平的NDM29會使APP在mRNA及蛋白質水平表達增加,同時可使BACE1的切割活性增強,進而促進兩種主要的Aβ異構體Aβ42和Aβ40的產生,并且明顯升高Aβ42/Aβ40比值,而Aβ42是AD病理斑塊的主要組成成分[27]。綜上可知,NDM29與AD發病機制有一定關聯,可增加毒性Aβ的產生。

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是哺乳動物大腦中非常重要的神經營養因子之一,與突觸功能、神經發生和認知功能密切相關,可使神經元免受損傷并促進受損神經元修復[28]。相關證據表明,BDNF可能通過激發非淀粉樣蛋白生成加工途徑來調節APP生成,從而減少Aβ的產生[29]。lncRNA BDNF-AS是BDNF的天然反義轉錄物,可通過改變BDNF的染色質結構來抑制BDNF mRNA轉錄位點,使BDNF表達水平降低,促進神經毒性Aβ的產生[30]。針對BDNF-AS/BDNF mRNA/BDNF信號通路的研究或許能為AD的藥物研發提供新的思路。

17A是依賴于RNA pol Ⅲ的lncRNA,可嵌入人G蛋白偶聯受體51(G-protein-coupled receptor 51,GPR51)基因內含子3的反義方向,影響GPR51選擇性剪接(AS),并促進γ氨基丁酸B型受體2(γ-aminobutyric acid type B receptor 2,GABABR2)可選擇性和非功能性剪接異構體的形成,降低GABABR2典型異構體的轉錄,這一事件顯著損害了GABAB信號通路,使Aβ分泌增強,并以增加Aβ42/Aβ40比值為主[18]。Massone 等[31]報道,17A 在AD患者腦中響應炎癥刺激而表達增加,從而促進Aβ分泌并增加其積累,提示其可能直接或間接參與了AD的發病機制。

核富集豐富轉錄本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)是人11號染色體特定位點轉錄產生的lncRNA,分為NEAT1-1(3.7 kb)和 NEAT1-2(22.7 kb)兩種亞型[32]。Wang 等[33]研究發現,NEAT1下調通過抑制內吞相關基因的表達減少介導Aβ清除的神經膠質細胞。具體機制為:NEAT1-1沉默使得內吞相關基因轉錄起始位點附近組蛋白H3K27乙酰化(H3K27Ac)下調和H3-K27巴豆?；?H3K27Cro)上調,并介導轉錄因子STAT3與H3K27Ac相互作用,降低多個相關基因的表達,從而削弱內吞作用,造成Aβ清除減少、沉積增加。但Zhao等[34]的研究卻發現,NEAT1在AD小鼠模型中顯著上調,而miR124顯著下調,敲除NEAT1或過表達miR124對Aβ誘導的AD模型具有保護作用,說明NEAT1可能通過調節miR-124在AD的發展中發揮作用。Ke等[35]還發現,NEAT1可以作為miR-107的“分子海綿”,使Aβ誘導的神經元損傷加重?？傊?以上研究提示,NEAT1通過多種作用機制參與Aβ的代謝過程,與AD發病密切相關,可能為AD的診斷及治療提供新的研究靶點。

除此以外,腦胞質200(brain cytoplasmic 200,BC200)、Sox2重疊轉錄本(Sox2OT)等 lncRNA 也可通過特定的作用機制參與AD的發生發展[19]?？傊?近幾年來,針對lncRNA與AD關系的研究結果得到很多關注,lncRNA這一新型分子的發現對于揭示AD潛在發病機制具有極其重要的意義,有益于藥物研究的發展和臨床診治水平的提升。

3.2 lncRNA與帕金森病

PD是第二常見的進展緩慢的NDDs,影響2%～3%的65歲以上人群。此病主要特征是黑質-紋狀體系統多巴胺能神經元進行性變性,導致紋狀體多巴胺缺乏,繼而引起運動功能障礙。PD主要臨床運動癥狀包括靜止性震顫、肌張力增高、運動遲緩和姿勢不穩,這也是其臨床診斷的基石[36]。迄今為止,該疾病都不能得到充分的治療,現用藥物只能緩解癥狀和延緩進展[37]。近年來,研究發現,大量lncRNA在PD患者和PD實驗模型中差異表達,它們通過影響α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)沉積、溶酶體自噬系統、多巴胺神經元凋亡、神經炎癥等方面參與PD發病機制[37～38]。

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxyterminal hydrolase L1,UchL1)是一種神經元限制性蛋白,作為去泛素化酶或單泛素穩定劑發揮作用,UchL1基因突變已被報道與家族性PD密切相關,并且有報道稱PD患者腦中Uchl1蛋白出現氧化失活[39]。lncRNA UchL1-AS是UchL1的反義轉錄本,在多巴胺能神經元的細胞核中含量豐富,它是SINEUPs(上調翻譯的SINEB2序列)的代表成員,可以在轉錄后水平增加UchL1的蛋白質合成,進而參與PD發病過程[40]。Zhang等[41]發現,在PD動物模型中lncRNA SNHG14的表達水平升高,沉默的SNHG14可以通過miR-133b下調α-syn生成和聚集,減輕多巴胺能神經元損傷,改善PD的病理狀態。磷酸酶和張力素同源物誘導的激酶1(phosphatase and tensin homologue-induced kinase 1,PINK1)是PD相關的易感基因,其缺失或過表達可導致多巴胺釋放受損和運動缺陷,naPINK1是PINK1基因座特異性反義轉錄本,可以穩定PINK1的表達,調控線粒體氧化應激[7]。Yan等[42]的研究發現,lncRNA NEAT1可通過穩定PINK1蛋白,促進1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導的PD小鼠的自噬,從而減輕多巴胺能神經元的損傷。此外,MALAT1可與α-syn結合,增強其穩定性,導致α-syn表達增加;同時也能充當miR-124-3p與miR-129的“分子海綿”,參與調控PD神經元凋亡[37]。多種lncRNA通過特定的通路在PD的病理過程中發揮重要作用,這使得lncRNA有望成為PD早期檢測的生物標志物,并可為PD靶向治療的發展提供新思路。

3.3 lncRNA與多發性硬化

MS是一種主要由細胞免疫介導的CNS慢性炎性脫髓鞘疾病。MS發病機制不明,全球患病人數200～300萬,是目前青壯年神經系統非創傷性殘疾的最常見原因[43]。已有研究表明,lncRNA失調在炎癥和自身免疫性疾病的發病機制中發揮關鍵作用[44]。近年來,研究人員在MS患者及體外模型中也發現了異常表達的lncRNA,并發現lncRNA主要通過調控CD4+輔助性T細胞(helper T cell,Th cell)的分化參與MS發病機制[45]。

linc-MAF-4是一種染色質相關的CD4+Th1特異性lincRNA,其表達水平與Th2相關的轉錄因子MAF的表達呈負相關[46]。Zhang等[47]對MS患者和健康對照組的外周血單個核細胞進行了微陣列分析,發現MS組的linc-MAF-4表達明顯高于對照組;進一步將合成的linc-MAF-4轉染初代CD4+T細胞,發現linc-MAF-4可通過抑制Th2細胞的轉錄因子MAF,促進Th1細胞分化,抑制Th2細胞分化,進而促進MS發生。DNA損傷誘導轉錄因子4(DNA-damage-inducible transcript 4,DDIT4)是一種高度保守的應激反應基因,為lncDDIT4順式調控的候選靶點,MS大規模全基因組關聯研究發現lncDDIT4高表達[48]。研究證明,lncDDIT4的過表達通過增加CD4+T細胞中DDIT4 RNA的表達并降低DDIT4-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路的激活,抑制Th17細胞分化,而Th17細胞的異常分化與MS密切相關[49]。Cardamone等[50]的體外細胞實驗顯示了lncRNA MALAT1在調節MS相關的AS事件方面的作用,提示它參與了MS發病機制。MALAT1可參與炎癥反應過程,CD4+T細胞中MALAT1低表達可刺激T細胞向致病性Th1和Th17表型分化,抑制調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)分化,這有可能是其參與MS發病的作用機制,但需要相關研究進一步證實[45]。Shaker等[51]檢測了MS患者血清MALAT1表達水平,發現患者血清MALAT1水平相較于對照組顯著升高,并且在復發緩解型MS患者中升高得更明顯,提示其水平可能與MS病程及進展相關。此外,HOX轉錄反義基因間RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR)、INK4位點的反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)、生長抑制特異性轉錄本5(gowth arrestspecific transcript 5,GAS5)等lncRNA也與MS發病機制存在一定關聯[45]。以上研究結果表明,lnc-RNA主要通過調控炎癥細胞的分化參與MS的發病機制,提示lncRNA有作為MS生物標志物的潛力,相關信號通路的研究也可能為MS的靶向治療提供理論依據。

3.4 lncRNA與亨廷頓病

HD是亨廷頓蛋白(huntingtin,HTT)編碼基因的多聚谷氨酰胺區(polyglutamine,polyQ)胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(cytosine-adenine-guanine,CAG)重復序列的異常擴增導致的常染色體顯性遺傳病,臨床以認知功能障礙、手足舞蹈病和精神障礙為特征[52]。一項微陣列數據分析顯示,HD患者大腦中存在數個表達失調的lncRNA,比如HTT反義轉錄物(antisense transcript of HTT,HTT-AS)等,提示lncRNA可能與HD發病相關[53]。

HTT-AS可交替剪接成HTT-AS-v1和HTTAS-v2兩種類型。內源性HTT-AS-v1已被證實在體內對HTT有直接的調節作用,降低HTT-AS-v1的表達可導致內源性HTT表達增加20%,相反,HTT-AS-v1的過表達使內源性HTT表達降低約25%,暗示提高HTT-AS表達可能是HD治療的重要途徑[54]。研究發現,lncRNA NEAT1在HD基因敲入小鼠和HD患者紋狀體神經元中表達增加,其升高依賴于突變型亨廷頓蛋白(mutant huntingtin,mHTT),這些生物學結局可能與NEAT1和p53相互作用后改變p53穩定性或者NEAT1直接影響蛋白酶體降解有關[52,55]。?；撬嵘险{基因1(taurine upregulated gene 1,TUG1)是一種剪接的lncRNA,為一種促生存因子,有研究提示,TUG1可作為p53的下游靶點被上調,從而產生神經元保護作用,使其免受mHTT引起的細胞毒性效應[53,56]。此外,人類加速區1(human accelerated region 1,HAR1)、母系表達基因3(maternally expressed gene 3,Meg3)等lncRNA也與HD發病存在一定聯系,但是這些lncRNA在HD患者腦內的表達水平差異較大,具體作用機制也有待進一步研究[53]。2021年,Tan等[57]系統分析了HD患者的基因表達譜數據,篩選出差異表達的490個mRNA和94個lnc-RNA,并建立了mRNA與lncRNA的蛋白質相互作用網絡譜,發現競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)網絡中存在多種轉錄因子的相互作用,提示lncRNA可能通過控制這些蛋白質編碼基因的表達,特別是轉錄因子的表達,調控HD的發病。該研究為揭示lncRNA在HD中的作用機制提供了新的線索,未來需要進一步的實驗來驗證上述ceRNA調控網絡譜,并闡明其在HD發病機制中的作用。

3.5 lncRNA與其他NNDs

ALS是一種以上、下運動神經元損害為突出表現的慢性進行性疾病,表現為肌肉萎縮、球麻痹和錐體束體征等[58]。2021年,Liu等[59]通過生物信息學分析發現,MALAT1參與調控的SYNRG、ITSN2、AAK1等基因可能與ALS發病機制有密切關系,這為ALS的研究提供了新的視角。額顳葉癡呆(frontotemporal dementia,FTD)是一組以大腦額葉和顳葉前部萎縮為特征的慢性進行性CNS變性疾病[60]。交互反應DNA結合蛋白43(transactive response DNA-binding protein 43,TDP-43)和肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma,FUS)在胞漿內異常聚集是FTD的特征[61],充分了解導致TDP43和FUS異常沉積的通路可為FTD的研究提供新思路。脊髓小腦共濟失調8型(spinocerebellar ataxia type 8,SCA8)與大腦特異表達的lncRNA ATXN8OS相關,推測與其參與調控臨近的蛋白質編碼基因KLHL1有關[62]。SCA7由ATXN7基因中胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)重復序列異常擴增引起,lncRNA ATXN7L3B可與ATXN7 mRNA相互作用,影響ATXN7表達,提示lncRNA可能參與調控SCA7 發病過程[63]。

4 總結與展望

綜上所述,lncRNA作為一大類不編碼蛋白質的 RNA,在 AD、PD、MS、HD 等多種 NDDs中發揮重要的調控功能,不同lncRNA可通過多種作用模式,在轉錄前、轉錄過程及轉錄后水平調節與上述疾病有關的基因表達過程,將lncRNA作為NDDs有價值的生物標志物或治療靶點是值得期待的。雖然目前lncRNA在NDDs發病機制中的確切作用機制仍不甚清楚,但是隨著基因調控研究的不斷深入和更多生物學方法的涌現,lncRNA生物學功能和分子機制必將被進一步闡明,這將為NDDs的診斷及治療提供更多的理論指導。