固有淋巴細胞與病毒感染的研究進展

崔 偉,張志偉,楊二霞,姜 莉

(艾美康淮生物制藥(江蘇)有限公司,中國江蘇 泰州 225300)

固有淋巴細胞(innate lymphoid cells,ILCs)來自共同淋巴樣祖細胞(common lymphoid progenitor,CLP),是一群具有獲得性免疫功能的天然淋巴細胞家族。ILCs廣泛分布于肺部、結腸、口腔黏膜、淋巴結,甚至胚胎組織[1]。其主要對寄生蟲感染及病原體胞內感染產生免疫反應[2],同時對機體抵抗感染所誘發的炎癥反應進行調節,以維持和重建屏障系統[3]。此外,ILCs在非淋巴系統中的分布,預示其不僅具有抗炎作用,亦可能對組織的發育、完整性及穩態具有重要作用。當病原體入侵機體時,ILCs由于分布的位置優勢往往成為與病原體率先發生作用的細胞之一,并由此引發獲得性免疫。本文主要就ILCs細胞亞群的不同表型的功能特性及其在抗病毒感染中的作用等研究進展進行綜述。

1 ILCs的表型、發育及功能特點

成熟的ILCs具有3個典型特征:缺乏重組激活基因(recombination activating gene,RAG)依賴的抗原受體重排;缺乏其他淋巴細胞和髓系相關細胞表面標記物;不表達T細胞或B細胞受體(T/B cell receptor,TCR/BCR)。根據ILCs效應功能、所分泌細胞因子及表達的轉錄因子的差異,其分為3種類型:Ⅰ型ILCs、Ⅱ型ILCs、Ⅲ型ILCs。Tufa等[4]將獲得CD48和CD52的人類CLPs(CD34+CD117+α4β7+Lin-)定義為 ILC 前體(ILC precursors,ILCps)和 NK 祖細胞(NK progenitors,NKPs)。ILCps存在于 CD34+CD117+α4β7+Lin-CD48+CD52+亞群中,能分化發展為ILC1s、ILC2s和NCR+ILC3s。因此,在細胞因子和表面受體信號的調節指導下,先天性淋巴祖細胞會發展不同亞型的ILCs[5]。

Ⅰ型ILCs包括經典的自然殺傷細胞(natural killer cells,NK cells)和ILC1。NK細胞表達Eomes和T-bet轉錄因子,與細胞毒性CD8+T細胞相似。ILC1是非細胞毒性的Ⅰ型ILCs,由白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、IL-15、IL-18[6]激活后產生γ 干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),表型為 T-bet+Eomes-,在功能上與CD4+T輔助細胞1型(Th1)相似[7]。Ⅰ型ILCs參與Ⅰ型天然免疫應答,具有抗胞內病原體感染(如病毒感染)和抗腫瘤免疫功能[7]。

ILC2由IL-33、胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、IL-25 激活,產生的細胞因子部分與CD4+Th2相似,如IL-5、IL-9和IL-13[8]。其發育及成熟需要轉錄因子α型維A相關孤兒受體(retinoid orphan nuclear receptor α,RORα)[9]和 B 細胞淋巴瘤/白血病 11B(B cell lymphoma/leukemia 11B,Bcl11b)的輔助[10],在2型天然免疫反應中發揮重要作用,參與胞外寄生蟲感染和過敏反應。此外,有研究表明,ILC2分泌的雙調蛋白(amphiregulin,Areg)參與組織損傷修復[11]。

Ⅲ型ILCs包括ILC3和淋巴組織誘導細胞(lymphoid tissue inducer cells,LTi)。根據趨化因子受體CCR6的表達差異,Ⅲ型ILCs可分為CCR6-ILC3、CCR6+LTi[12],其中,LTi細胞又可分為CD4+LTi細胞或CD4-LTi細胞[13]兩個亞群,CCR6-ILC3細胞則可根據NK細胞毒性受體(natural killer cell receptor,NCR)[14]的表達進行細分。ILC3可被IL-23 和 IL-1β[6]激活,表達 RORγt,分泌 IL-17、IL-22、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和效應細胞因子TNF-α[15]。ILC3的功能與Th17細胞相似,在抗細胞外微生物感染(如細菌和真菌感染)中承擔著重要角色。

Eken等[16]將人類ILCs表型做出定義,ILC1為Lin-cKit-CRTH2-CD127+CD161+CD3-,ILC2為Lin-CRTH2+CD127+CD161+CD3-,ILC3為Lin-cKit+CRTH2-CD127+CD161+CD3-。但是,ILCs分組不是絕對的[17],因為ILC2和ILC3在一定的條件下都可以轉化為ILC1[18],且ILC1與ILC3在發育過程中所依賴的轉錄因子部分相似,這可能預示著ILCs具有一定的可塑性。例如,小鼠體內的早期Lin-CD127+Flt3-淋巴祖細胞,可以分化出所有的ILCs亞群[19],面對環境刺激時,會分泌細胞因子、神經肽、激素等[20]。總體而言,這些ILCs群體在不同物種及不同組織中的表達具有差異性,對其表型描述的探索研究仍在繼續,相信隨著研究的不斷深入,其表型將更加明確。

2 ILCs在抗病毒感染中的作用

研究表明,ILCs可以促進與病毒感染相關的天然免疫和獲得性免疫[21]。但ILCs亞群放大或限制免疫應答的具體機制目前尚不明確。根據已有研究資料,我們將ILCs對不同病毒感染的免疫應答方式進行整理和介紹。由于NK細胞和LTi細胞的免疫功能已有相關綜述報道,本文著重綜述ILC1、ILC2和ILC3亞群在抗病毒感染中的效用。

2.1 ILCs與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2

有別于其他病毒,嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe scute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的病毒載量無法作為區分病癥嚴重程度的指標,例如:輕癥兒童的病毒載量可能會與重病成人相當[22]。研究發現,新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的嚴重程度僅受年齡依賴性的疾病耐受機制影響,而ILCs等淋巴細胞,與促進疾病耐受性有密切關聯[23]。也有研究者發現,COVID-19重癥患者除了呼吸窘迫、缺氧、器官衰竭等病癥外,過度激活的免疫反應也可能發生,從而觸發全身性細胞因子風暴循環障礙,導致循環休克[24～26]。因此,有理由相信ILCs能在COVID-19的診斷和治療中承擔一定作用。

Silverstein等[23]的研究顯示,ILCs豐度與COVID-19患者的住院需求、住院時間和炎癥嚴重程度有關。同齡、同性別的健康人群的ILCs豐度是COVID-19住院患者的1.78倍(95%CI:2.34～1.36;P=4.55×10-5);住院患者的ILCs豐度每增加兩倍,住院時間減少9.38 d[23]。Kuri-Cervantes等[27]研究發現,COVID-19重癥患者的ILCs水平異常,表現為遠低于中癥、康復和健康對照人群。García等[28]發現,中、重癥患者體內總CD127+ILCs和ILCps下降,ILC1豐度相對保持不變,但ILC2卻有所區別;總ILC2和CD117-ILC2在中度患病組升高,卻在重度COVID-19患者中下降。其原因可能是ILC2的趨化因子受體(CXCR3和CCR6)表達失調。同時,ILC2與系統性生物標志物(D-二聚體凝血因子)水平、器官/肌肉損傷標志物(肌紅蛋白、肌鈣蛋白T、乳酸脫氫酶)水平以及癥狀出現后的天數呈負相關,說明低水平的ILC2是病情加重的重要標志。Zizzo等[29]報道,IL-33是驅動COVID-19所有階段(即無癥狀、輕度-中度、重度-臨界和慢性-纖維化)的關鍵因素:IL-33誘導ILC2的分化,轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)增強ILC2上ST2的表達,促進IL-9的產生。效應記憶Vγ9Vδ2+T細胞因IL-9反刺激作用得到擴張增殖,表達CXCR3,并被CXCL9和CXCL10募集到肺部;IL-33-ST2會增加表達GM-CSF的T細胞數量,抑制抗病毒干擾素反應,引發過度炎癥,并促進血栓形成。也有研究表明,IL-18刺激并誘導NKG2D+ILC2表達增加,NKG2D+ILC2在NKG2D受體與其配體結合時產生抗炎介質,有利于終止炎癥[30]。綜上可知,ILCs在COVID-19患者病情診斷與減少重癥患者高死亡率背后發揮著重要作用。

2.2 ILCs與呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染在嬰幼兒和老年人群體中有較高的發病率與死亡率,嚴重威脅著公眾的健康。通常情況下,RSV率先感染肺部上皮細胞,嚴重的RSV感染可以引起氣管上皮細胞破壞及脫落黏液生成、細支氣管炎癥及肺功能障礙[31]。已有研究表明,肺部駐留的ILC2是RSV感染早期IL-13的主要來源,ILC2很大程度上通過TSLP依賴性機制分泌IL-13。TSLP通過與ILC2表面的TSLP受體結合,直接作用于ILC2,使其增殖并分泌IL-13、IL-5。但在體外環境下TSLP不能直接激活ILC2,這表明在體內環境中TSLP對ILC2的激活需要其他信號分子的協同作用[32],例如:IL-33、IL-25、促炎分子[如半胱氨酸白三烯(白三烯D4)]和TNF家族細胞因子(尤其是 TLIA)[33～34]。另外,Stier等[35]的研究報道,在RSV感染過程中,信號轉導及轉錄激活因子1(signal transduction and activator of transcription 1,STAT1)通過調控IL-33和IL-23進而調控ILCs的應答,STAT1信號通路可通過多種機制發揮ILC1的抗病毒作用,并抑制免疫病理相關的ILC2和ILC3反應。因此,在RSV感染過程中,ILCs所誘發的協同免疫效應使機體在清除病毒的同時,也可能限制免疫病理反應。但刺激ILCs活化所需的細胞因子網絡有待進一步研究。

2.3 ILCs與流感病毒

流感病毒感染小鼠會導致肺部ILCs的累積,具體表現為:流感病毒感染誘導肺泡巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)分泌IL-33,進而誘導ILC2活化產生IL-5和IL-13,使肺內嗜酸性粒細胞聚集[36],從而誘導呼吸道高壓反應[37]。Li等[36]研究表明,抗CD90.2處理可以使Rag2-/-小鼠體內的ILC2耗竭,抑制H3N1-誘導的呼吸道高壓反應。這表明ILC2產生的IL-5和IL-13可能與哮喘加重有關。但ILCs缺失會導致氣管上皮完整性喪失、肺功能下降和氣管重塑受損。Vashist等[38]發現,在流感病毒感染兩天后肺組織中的ILC1(分泌IFN-γ)會顯著增加。而且,初次感染的小鼠肝臟內留存的記憶樣ILC1被過繼轉移至感染流感的Rag1-/-小鼠體內后,會產生明顯保護作用[36]。此外,甲型流感病毒雖然會刺激ILC2,引起急性氣道高反應,但在感染恢復期,ILC2卻發揮著治愈的作用,例如:ILC2分泌的Areg有助于促進肺穩態的形成[39]。ILC2對肺穩態的調節效應在Duerr等[40]的研究結果中亦有體現:流感病毒感染使ILC2表面標志分子GATA3及IL-33受體ST2表達降低,IL-33-IL-33R信號通路受損的小鼠在流感病毒感染后肺組織中的ILCs顯著減少、肺功能和呼吸道上皮組織嚴重受損。綜上所述,ILC2在流感病毒感染早期的快速增殖,使得炎性細胞聚集,從而引發一定的呼吸系統病理反應,但在恢復期對氣管和肺部發揮穩態調節作用。因此,對ILC2的相關研究,有助于流感病毒感染的早期治療和后期恢復。

2.4 ILCs與免疫缺陷病毒

腸道完整性喪失,伴有大量微生物產物快速地從腸腔轉移到固有層、血液、淋巴結和肝臟,是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)的病原性感染特征之一。同時,產生的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、可溶性CD14分子(soluble cluster of differentiation 14,sCD14)等微生物易位標志物,激活機體免疫并產生炎癥反應。ILCs(尤其是ILC3)在維持腸道組織建模、修復和完整性中發揮著重要作用[41],因此ILCs可能在HIV/SIV感染致病的病理生理學中,亦扮演著重要角色。

Xu等[42]通過研究感染SIV的恒河猴發現,黏膜組織ILC3表達高水平的RORγt,較NK細胞更早產生IL-17、IL-22和TNF-α。另有研究報道,感染 SIV 后,ILC3產生大量的 TNF-α、IFN-γ、人巨噬細胞炎癥蛋白1β(macrophage inflammatory protein 1β,MIP-1β),但 IL-17 水平顯著降低[43]。該結論在另一項研究中得以證實,在SIV急性致病性感染期間(感染后7～14 d),產生IL-17的ILC3顯著減少,感染后14～21 d ILCs的總數量增加,感染后28 d ILCs再次減少并伴有病情惡化[44]。

Dillon等[45]研究發現,在HIV-1慢性感染未治療期間,結腸中表達IFN-γ的炎癥性NKp44+ILCs數量增多。Kr?mer等[46]卻報道,HIV感染者體內ILCs的耗竭與CD127+ILC1和ILC3的減少相關。HIV在小鼠模型上的研究表明,持續的HIV-1感染會將ILC3耗盡,缺少ILC3導致感染者腸道內穩態難以維持,但有效的抗逆轉錄病毒療法(antiretroviral therapy,ART)逆轉了這一損失[47]。相同結論在Li等[48]的研究中也有提及,HIV患者血液中的3種ILCs亞群在感染后均被耗盡,但ART的早期應用使得所有ILCs亞群在耗盡后再次恢復;同時,該研究還發現,若感染后5～14 d內不給藥,則只有ILC3部分恢復,ILC1和ILC2仍處于衰竭狀態。不同的是,在HIV感染的哺乳期婦女血液中ILCs顯著減少,但母乳淋巴細胞中的ILCs與未感染者無顯著差異[49]。

HIV感染導致ILC3丟失并非由于直接感染,因為ILCs不表達SIV/HIV的受體,在這類細胞中人們也未能檢測到SIV/HIV;進一步的研究發現,免疫缺陷病毒的黏膜急性感染導致ILC3丟失,是因為凋亡細胞增加、炎性細胞因子(如TGF-β、IL-2、IL-12、IL-15)抑制 RORγt表達[50]。Kl?verpris等[51]也發現,在HIV-1急性感染期,ILCs表達的膜聯蛋白V上調與細胞凋亡密切相關;ILCs丟失與CD69、組織歸巢標志α4β7和Fas凋亡受體CD95高表達相關。Xu等[43]特別指出,慢性感染期微生物移位,使外周及腸道中脂磷壁酸和LPS等產物與ILC3表面Toll樣受體2/4(Toll-like receptor 2/4,TLR2/4)結合,進而導致ILC3細胞凋亡,且ILC3的丟失與CD4+T、Th17、Th22細胞的減少具有一定的相關性。綜上可知,HIV感染導致ILCs丟失與細胞凋亡有關。

2.5 ILCs與鼻病毒

鼻病毒(rhinovirus,RV)感染是兒童哮喘發作的重要誘因[50],但具體的發病機制目前尚不清楚。RV病毒可引起哮喘兒童PBMCs中IL-33、IL-25表達上調,此類細胞因子具有激活ILC2的效應[52]。患哮喘疾病的兒童在感染鼻病毒后,血液中ILC2標志分子ST2降低[53],這可能與血清中25(OH)-VitD3和ILC2活化相關的細胞因子IL-33發生中和作用有關[54]。上述分析表明,ILC2在兒童RV病毒感染誘發哮喘的過程中發揮著重要作用。

研究發現,IFN-γ可抑制RV感染的幼鼠體內的ILC2的增殖和IL-13的表達,減少黏液化生和哮喘發生[55]。還有研究發現,RORα抑制劑(SR-3335)可阻止RV誘導的肺組織中的ILC2增加[56],并抑制IL-13的表達[57],這可在一定程度上控制RV引起的哮喘表型。這些研究表明,對細胞免疫通路的深入研究將有助于識別預防哮喘的細胞和分子靶點。

2.6 ILCs與肝炎病毒

肝炎病毒感染已被認為是肝炎發展的一個關鍵因素,并導致持續性炎癥狀態,影響肝臟結構和功能。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相關肝炎癥的潛在分子機制主要涉及宿主對HBV病原體的免疫應答。在慢性乙肝病人肝組織中,ILC1分化相關的轉錄因子T-bet、效應分子IFN-γ、信號分子IL-12/IL-12R顯著上升,相比之下,IL-33、ST2、GATA3、IL-13 等 ILC2 相關因子的升高程度均低于ILC1,且ILC2的活性與HBV拷貝數或肝損傷程度均無相關性[58]。研究發現,ILC1在慢性乙型肝炎發病機制中可能具有促炎作用[59];肝組織損傷后釋放的IL-33可激活ILC2表達IL-13、IL-5,從而參與免疫介導型肝炎[60];ILC3分泌IL-22在急性肝炎中發揮保護作用[61]。在慢性丙型肝炎患者中,ILC1表達的NKG2A增加[62],抑制IFN-γ+NK細胞募集所需的CXCL9表達,而IFN-γ對DC細胞活化及病毒特異性CD8+T細胞啟動至關重要。因此,阻斷ILC1中NKG2A表達,使得DC細胞向肝組織靶向遞送抗原,可產生持續的CD8+T細胞反應,從而顯著提高疫苗的療效,有利于肝組織病原體的清除。這為新型肝炎病毒疫苗的開發提供了新策略。

2.7 ILCs與腸道病毒

柯薩奇病毒A16型(Coxsackie virus A16,CA16)作為腸道病毒家族成員之一[63],與腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)類似,是引起兒童手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)的主要病原體,這兩種病毒引起的HFMD病例達總病例的80%[64]。有研究發現,EV71病毒感染的重癥患者PBMCs的ILC1(CRTH2-CD117+)增加,可能是ILC1的關鍵轉錄因子T-bet、GATA3和RORγt的高表達導致,而高頻率的循環ILC1使得病毒性腦脊髓膜炎和病毒性腦炎風險提高2.9倍[65]。

為了弄清在CA16病毒和EV71病毒感染過程中ILCs發揮何種作用,以及CA16和EV71滅活抗原能否誘導核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號轉導通路激活并表達相關免疫信號分子,筆者團隊進行了一系列基礎研究,發現活病毒和滅活的病毒抗原均能使誘導ILCs活化所需的信號通路分子表達增加,進而使ILCs分泌的細胞因子(TNF-α、RANKL、GITRL 等)增加[66];CA16 和EV71病毒抗原與ILC1/ILC3分別存在共定位現象,病毒抗原進入呼吸道黏膜組織后,ILCs被明顯激活[67]。此外,筆者團隊還發現,將EV71和CA16抗原接種到上皮組織中能夠誘導與ILCs有關的多種免疫信號分子的表達,如將抗原刺激傳遞至DC細胞。DC細胞和ILCs之間的協調作用有助于新生小鼠成功獲得針對疫苗抗原的完整適應性免疫反應,并潛在地發揮著類似于自然病毒感染誘導的臨床保護作用[68]。

3 總結與展望

ILCs作為一種新的非B、非T淋巴細胞,在進化起源、譜系特異性轉錄因子、發育功能方面與天然淋巴細胞和適應性淋巴細胞有極大的相似性。但ILCs主要作為屏障防御的管理者發揮作用,這使它們與適應性淋巴細胞不同。ILCs的發現和研究改變了人們對免疫調節以及免疫系統如何維持組織穩態的認識。ILCs是天然免疫細胞網絡中必不可少的一類細胞,在抗病毒感染中發揮免疫保護和維持免疫平衡的作用,其激活和增殖依賴特定的細胞信號分子。ILCs被激活后產生的效應分子,是組織在病毒感染早期抵御病原體的關鍵信號因子,參與促進組織炎癥或修復,但在病毒感染后的機體中,ILCs產生免疫應答的具體機制及其促進炎癥或組織修復的分子途徑尚待闡明。這些關鍵機制的研究將有助于加深人們對機體抗病毒免疫反應的認識,有助于提出更加有效的抗病毒策略。