花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266增殖和凋亡的影響及機制

劉 敏，雷薈融，成延娟，唐元艷，黃知平（荊州市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，湖北 荊州 434020）

多發(fā)性骨髓瘤是全球范圍內(nèi)的惡性漿細(xì)胞病，起源于B淋巴細(xì)胞系。據(jù)統(tǒng)計資料顯示，多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病率在血液系統(tǒng)腫瘤內(nèi)位居第二，發(fā)病人數(shù)占血液系統(tǒng)腫瘤10%，嚴(yán)重影響患者生命健康安全［1］。目前多發(fā)性骨髓瘤的治療方式有化療、放療及造血干細(xì)胞移植等，盡管在治療上取得了很好治療效果，但仍會出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治現(xiàn)象［2］。純天然藥物治療是近幾年研究的熱點，花姜酮（zerumbone）是從野生姜根莖部位提取的一種蛇麻烷型倍半萜，具有良好抗腫瘤效果［3］。有研究顯示，花姜酮呈劑量依賴性抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。花姜酮能抑制胃癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5-6］。還有研究結(jié)果顯示，花姜酮能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［7］。以上均說明花姜酮具有良好抗腫瘤作用，但是對多發(fā)性骨髓瘤的作用尚無明確報道。

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種高度保守的細(xì)胞核蛋白，是一個動態(tài)功能多效分子，在多種腫瘤高表達(dá)，包括多發(fā)性骨髓瘤［8］，如miR-410通過靶向抑制HMGB1，進(jìn)而抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［9］。在多發(fā)性骨髓瘤患者血清內(nèi)，HMGB1高表達(dá)，且與腫瘤分期、患者3年生存率負(fù)相關(guān)，敲低HMGB1可抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞的凋亡和自噬［10-11］，表明HMGB1可能是腫瘤治療靶點。本研究以U266細(xì)胞為研究對象，探討花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響，及其是否與HMGB1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

花姜酮購于上海源葉生物公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；RNA試劑盒均購于美國Invitrogen公司；引物均購于上海吉瑪公司；MTT試劑盒購于日本同仁公司；凋亡試劑盒購于江蘇凱基生物；一抗：兔抗人周期蛋白D1、Bax、Bcl-2、HMGB1單克隆抗體，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠IgG抗體（二抗）購于北京中杉金橋公司；胰酶、化學(xué)發(fā)光液、DMSO、結(jié)晶紫和BCA試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；PrimeScript RT試劑盒和熒光定量試劑盒購于美國Thermo Fisher公司。Biosciences AccuriC6流式細(xì)胞儀購于美國BD Bioscience公司；Varios-kan LUX多功能酶標(biāo)儀和VeritiPro PCR儀購于美國Thermo Fisher公司；凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理

多發(fā)性骨髓瘤U266購于美國典藏中心；取出在超低溫冰箱保存的U266細(xì)胞，采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞生長密度變化進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期的U266細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用花姜酮 0（細(xì)胞對照組），5，10 和 20 μmol·L-1處理U266細(xì)胞48 h。

1.3 MTT實驗檢測細(xì)胞存活率

取1.2分組處理的細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書加入20 μL MTT（5 g·L-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入150 μL DMSO（1%）試劑，結(jié)晶紫溶解后，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測細(xì)胞吸光度（A490nm）值，并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實驗組A490nm-空白組A490nm）/（細(xì)胞對照組A490nm-空白組A490nm）×100%。

1.4 克隆形成實驗檢測克隆形成率

取1.2分組處理的細(xì)胞，接種至6孔板內(nèi)，每孔內(nèi)接種500個細(xì)胞，然后置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d，肉眼觀察可見克隆形成時終止培養(yǎng)，經(jīng)過PBS沖洗后加入4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min后，在顯微鏡下觀察克隆細(xì)胞數(shù)目，計算克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆細(xì)胞數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取1.2分組處理的細(xì)胞，加入胰酶消化，清洗3次后重懸細(xì)胞，根據(jù)凋亡試劑盒說明書，將5 μL Annexin V-FITC試劑和PI試劑加入至200 μL結(jié)合緩沖液內(nèi)，待混勻后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期的U266細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按1.2分組處理細(xì)胞，157×g離心5 min，吸除上清，加入約1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團。每管細(xì)胞中加入0.5 mL PI染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30 min。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測細(xì)胞周期。

1.7 RT-qPCR檢測U266細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)

收集1.2分組處理的細(xì)胞，按照RNA試劑盒說明書，加入RNAiso Plus試劑分離各組細(xì)胞用于提取RNA，用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。取1 μg RNA按照PrimeScript RT試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，HMGB1正向引物為5′-AGGATCCCAATGCACCCAAG-3′，反向引物為 5′-CGCAACATCACCAATGGACAG-3′；GAPDH 正向引物為 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，反向引物為5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3′。95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s、共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-△△Ct法定量mRNA表達(dá)水平。

1.8 Western印跡法檢測U266細(xì)胞周期D1、Bax、Bcl-2和HMGB1蛋白表達(dá)

收集1.2分組處理的細(xì)胞置離心管，加入1 mL蛋白裂解液在冰上裂解30 min，并提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，根據(jù)BCA法定量蛋白濃度。取20 μg蛋白質(zhì)，變性5 min，在80 V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE凝膠處理蛋白樣品，迅速轉(zhuǎn)膜，封閉培養(yǎng)1 h。然后加入抗周期蛋白 D1（1∶800）、Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶800）、HMGB1（1∶800）和GAPDH（1∶1000）抗體，4℃孵育過夜；加入二抗（1∶1000）在室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光液顯影、曝光，用凝膠成像儀進(jìn)行拍照，使用Quantity One分析蛋白條帶積分吸光度值，以GAPDH作為內(nèi)參。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度值比值表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，采用SPSS 22.0軟件分析處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果（表1）顯示，與細(xì)胞對照組相比，花姜酮5，10和20 μmol·L-1能顯著降低U266細(xì)胞存活率（P＜0.05），提示花姜酮可有效抑制U266細(xì)胞存活。

Tab.1 Effect of zerumbone on cell viability of multiple myeloma U266 cells

2.2 花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞克隆形成率的影響

克隆形成實驗結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對照組相比，花姜酮5，10和20 μmol·L-1組克隆形成率顯著降低（P＜0.05），提示花姜酮能有效抑制U266細(xì)胞克隆形成。

Fig.1 Effect of zerumbone on clone formation rate of U266 cells.See Tab.1 for the cell treatment.A：Diagram of cell clone formation；B：Statistical plot of cell clone formation rate.Clonal formation rate（%）=number of clones/number of inoculated cells×100%.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.3 花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對照組相比，花姜酮5，10和20 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），提示花姜酮可有效促進(jìn)U266細(xì)胞凋亡。

Fig.2 Effect of zerumbone on apoptosis of U266 cells detected by flow cytometry.See Tab.1 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.4 花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，花姜酮5，10和20 μmol·L-1組S期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），G2和M期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），提示花姜酮能通過抑制細(xì)胞周期S期抑制U266細(xì)胞增殖（圖3）。

Fig.3 Effect of zerumbone on cell cycle of U266 cells detected by flow cytometry.See Tab.1 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.5 花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果（表2）顯示，與細(xì)胞對照組相比，花姜酮 5，10 和 20 μmol·L-1組細(xì)胞HMGB1mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），提示花姜酮能下調(diào)U266細(xì)胞中HMGB1mRNA表達(dá)。

Tab.2 Effect of zerumbone on mRNA expression of high mobility group protein B1（HMGB1）in U266 cells

2.6 花姜酮對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞周期蛋白D1，Bax，Bcl-2和HMGB1蛋白表達(dá)水平的影響

Western印跡法結(jié)果（圖4）顯示，與細(xì)胞對照組相比，花姜酮5，10和20 μmol·L-1組多周期蛋白D1、Bcl-2和HMGB1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），提示花姜酮能下調(diào)U266細(xì)胞周期蛋白D1，Bcl-2，HMGB1蛋白表達(dá)，并上調(diào)Bax蛋白表達(dá)。

Fig.4 Effect of zerumbone on protein expression levels of cyclin D1，Bax，Bcl-2 and HMGB1 in multiple myeloma cells by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，花姜酮處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266后，可抑制細(xì)胞活力，減少克隆形成率，增加細(xì)胞凋亡率，提示花姜酮具有良好的抗骨髓瘤活性，與實體瘤中觀察到的結(jié)果相似［5-7］。

惡性腫瘤細(xì)胞生長、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞主要以有絲分裂方式進(jìn)行增殖，推動細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，可促進(jìn)細(xì)胞增殖［12］。周期蛋白D1可調(diào)控細(xì)胞周期，在多種癌癥中高表達(dá)，如淋巴瘤、乳腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等［12-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤患者腫瘤細(xì)胞中周期蛋白D1表達(dá)上調(diào)，且過表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)［14-15］。本研究采用不同濃度花姜酮處理多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞后，周期蛋白D1蛋白表達(dá)、G2和M期細(xì)胞百分比明顯降低，說明花姜酮可能通過降低周期蛋白D1抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖。

Bcl-2家族、胱天蛋白酶家族是比較常見的凋亡相關(guān)基因，Bcl-2家族成員有兩大類，分別是抗凋亡（包括Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡（Bax和Bak等），Bcl-2和Bax是常用凋亡相關(guān)基因，二者相互拮抗共同促進(jìn)腫瘤發(fā)生凋亡［16］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度花姜酮處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞后Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯增加，說明花姜酮可能通過降低Bcl-2、增加Bax促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞增殖和凋亡對于維持機體中正常生理功能具有重要作用，若兩者失衡易造成機體功能障礙或腫瘤惡性發(fā)展。腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡兩者之間相互調(diào)控，可能涉及一些調(diào)控基因，如DNAJC1，TRIM31和HMGB1等［17-20］。HMGB1在多發(fā)性骨髓瘤高表達(dá)，抑制HMGB1能抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［21］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度花姜酮處理多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞后，HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，表明花姜酮能抑制HMGB1的表達(dá)。

綜上所述，花姜酮可抑制多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與下調(diào)周期蛋白D1、Bcl-2、HMGB1和上調(diào)Bax有關(guān)。然而，骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機制涉及多因子和多靶點，本研究尚未添加上述靶點的激活劑或抑制劑進(jìn)行反向驗證，仍需后續(xù)深入研究。