人肺類器官用于肺結核病研究進展及前景

鐘鵬飛，保鵬濤 ，檀英霞

（1.軍事科學院軍事醫學研究院衛生勤務與血液研究所，北京 100089；2.河北北方學院研究生院，河北 張家口 075000；3.解放軍總醫院第八醫學中心呼吸與危重癥醫學科，北京 100089）

結核病是一種由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，主要集中在東南亞、非洲和西太平洋地區，我國的結核病病例數量居世界第2位，僅次于印度。MTB可侵犯全身各器官，其中以呼吸道為主，肺結核最為常見。世界衛生組織于2014年提出了“終止結核病策略”，即2035年實現全世界范圍內消滅結核病［1］，但耐藥MTB的出現給該戰略帶來很大的挑戰。目前多藥耐藥結核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）的發病率不斷上升，且缺乏有效的治療藥物，使得患者預后不佳，嚴重威脅全球公共衛生安全［1］。因此，更深入地闡明MTB與宿主尤其是肺部各類型細胞（大多數肺結核發病的起始部位）的相互作用機制、開發更加經濟且有效的抗結核藥物迫在眉睫。

傳統細胞模型和動物模型在MTB感染機制研究中廣泛應用，是結核病研究的重要工具［2］。例如，人原代支氣管上皮細胞用于研究MTB對支氣管上皮細胞的侵染能力［3］，巨噬細胞用于研究MTB感染后MTB代謝的變化以及MTB對宿主的免疫調節等［4］。然而細胞模型細胞種類單一，缺乏與免疫調節密切相關的空間結構［5］。動物模型是研究肺結核病的有力工具，如家兔和豚鼠等，但因存在種屬差異，同時由于動物不是MTB的天然宿主，動物模型只能在一定程度上模擬肉芽腫形成和肺空洞等肺結核病的病理特征［6-7］。非人靈長類動物如獼猴是研究肺部MTB感染的較理想模型，幾可再現人類對MTB的所有宿主反應，但非人靈長類動物模型成本昂貴，且飽受倫理爭議。事實上，MTB感染可能開始于更早的時期，這在動物模型中很難跟蹤［8］。因此，亟需可以反映人體生理學和病理學特點的肺模型，這對于肺結核病致病機制研究、臨床早期診斷以及抗結核新藥研發均具有重要意義。

隨著干細胞和發育生物學的發展，類器官（organoids）的出現為人們提供了一種全新的體外研究模型，可實現體外再現體內源組織器官的關鍵結構和功能特性［9］。本文對人肺類器官的構建、在肺結核病研究中的進展及其潛在的應用前景等進行綜述。

1 類器官概述

類器官是一種衍生于多能干細胞（pluripotent stem cells，PSC）或成體干細胞體外3D培養構建的多細胞團［12］，其中PSC包括體細胞重編程而來的誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）［13］和胚胎干細胞［14］，而成體干細胞衍生的類器官可取自手術或活檢的健康或腫瘤組織。與傳統的細胞模型相比，類器官具有更加接近生理狀態的細胞類型和行為，并且保持著遺傳穩定性及可擴增性，研究數據更能代表人體內細胞真實的生理反應過程［10-11］。相對于動物模型，類器官的關鍵優勢是其為人類干細胞的衍生物，反映的是人體生理反應，而不是“類人”反應，更能準確地反映致病菌對人體的感染過程。因此，類器官彌補了傳統的細胞模型和動物模型的不足，研究數據能更好地轉化應用至人類本身，其中人肺類器官是研究呼吸系統疾病特別是肺結核病的一個獨特的模型。

2009年，Clevers團隊利用腸道隱窩基底處的富含亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5+（leucinerich repeat-containing G protein-coupled receptor 5+）腸道干細胞培育出世界上首個微型腸道類器官［15］。自此以后，類器官技術在人類科學研究發展史中拉開了帷幕，并迅速成為新的研究熱點，備受生物學界和臨床醫學研究領域的關注。目前3D類器官培養技術已成功培養出大量具有部分關鍵生理結構和功能的類組織器官，如腎［16］、肝［17］、肺［18］、腦［19］、胰腺［20］和視網膜［21］等。除形態還原度高外，類器官還具有可擴增和基因組穩定的特性，因而可使用與原代細胞相同的研究技術，如熒光標記、活細胞成像、電子顯微鏡、質譜和基因操作（如CRISPR-Cas9）等進行研究［22-23］，特別適合于生物學研究領域。現已廣泛應用于包括發育生物學［24］、疾病模型［25］、藥物篩選［26］和再生醫學［27］等研究。

2 人肺類器官的構建

肺起源于胚胎發育時的腹側前腸內胚層，其發育的不同階段受各種信號通路如Wnt、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）和轉化生長因子β信號通路等緊密協調和調控，誘導分化的主要步驟包括內胚層、前腸球體形成和近、遠端肺上皮細胞的分化［28］。源于人PSC誘導分化獲得的人肺類器官方案為：首先通過激活素A（activin A）的作用促使人PSC向內胚層分化，然后在FGF-4和Wnt信號通路激動劑CHIR-99021等因子作用下形成前腸內胚層，之后再加入一定濃度的FGF-10進一步培養誘導為人肺類器官［18］。此外，人肺類器官也可從臨床穿刺或切除的肺組織中分離的氣道基底細胞、棒狀（Club）細胞或Ⅱ型肺泡上皮細胞等分化而來［29-30］。

3 人肺類器官在肺結核病研究中的應用及前景

體外人體類器官是研究疾病病原學和病原體與宿主相互作用的獨特模型系統。目前，人PSC和組織來源的人肺類器官已成為研究多種呼吸道感染性疾病的有力工具，如隱孢子蟲［31］、銅綠假單胞菌［32］、呼吸道合胞病毒［33］、流感病毒［34］和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）［35］等感染性疾病，提示人肺類器官能夠極大地促進對呼吸道感染性疾病相關機制的研究。

3.1 在肺結核病研究中的應用

目前人肺類器官已用于模擬MTB感染及產生的炎癥應答，再現人體組織被MTB感染后產生的病理變化和免疫反應，從而為臨床治療提供參考。許多研究結果已表明，MTB主要通過侵入肺泡巨噬細胞并在吞噬體內復制引起原發性肺部感染。但也有學者認為，MTB可通過其他途徑，如通過入侵肺泡上皮細胞［36］、黏膜相關淋巴組織［37］或微褶細胞［38］觸發局部炎癥反應，釋放的趨化因子可募集各類免疫細胞并在此形成肉芽腫。Iakobachvili等［39］用顯微注射的方法將MTB注射至含有基底細胞、纖毛細胞和杯狀細胞的人細支氣管類器官管腔中探索感染的早期事件，發現MTB對上皮細胞的低嗜性；他們進一步分析肺類器官炎癥因子的表達水平，發現白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）和β-防御素1（βdefensin-1）在上皮細胞的表達顯著增加，有利于免疫細胞趨化并控制感染。此外，與氣道分泌物產生有關的黏蛋白5B（mucin 5 subtype B）和黏蛋白4等基因的表達均顯著降低，這可能有利于MTB在氣道中定植，但影響黏蛋白表達的具體機制還有待闡明。該研究通過氣道類器官在3D水平上揭示了感染早期MTB在宿主體內的適應性、細胞嗜性和宿主反應，同時也揭開了肺結核病體外研究的新篇章。

目前人肺類器官用于肺結核病研究的相關報道較少，期待更多的研究者使用人肺類器官這一獨特模型，進一步探索MTB的感染機制及其在宿主體內的進化、蟄伏和復蘇過程，從而為研發更多有潛力的抗肺結核病藥物或疫苗提供數據支撐。

3.2 在肺結核病研究中的應用前景

盡管當前人肺類器官用于肺結核病的研究剛剛起步，但它已廣泛應用于其他呼吸道感染性疾病的研究并取得很大進展。由此提示，該模型在構建肉芽腫模型、肺結核病機制研究、共病研究及抗結核藥物篩選等方面亦可能具有很好的應用前景，值得進一步探索。

3.2.1 構建肉芽腫模型

如前所述，肉芽腫組織是結核病典型的病理標志，其形成與MTB的上皮細胞相互作用有關［40］。作為控制MTB復制的關鍵結構，其同樣也可能成為促進病原體復制的“溫床”［41］。MTB在該結構內的存活狀態（休眠和復蘇等）代表了結核病的關鍵階段。已有研究表明，MTB在生存壓力下，通過上調三酰基甘油合酶1基因表達，從宿主細胞中獲取甘油三酯作為能量來源，進入休眠和耐藥狀態［42］。然而尚不明確MTB表達何種基因產物促進了宿主釋放甘油三酯，這種基因產物可能成為對抗休眠狀態并發展為耐藥性病原體的新藥靶標。因此，需要建立包含人類宿主細胞的體外肉芽腫模型進行觀察和驗證［43］，以研制新的針對性治療藥物。

目前，已通過多種方法建立了體外肉芽腫模型，如人外周血單核細胞肉芽腫模型［44］、膠原蛋白基質模型［45］、多細胞肺組織模型［46］和生物電噴霧3D模型［47］，闡明了部分免疫機制，然而上述模型有的過于簡單，缺乏其他的宿主細胞類型和細胞外基質；有的又過于復雜且通量低，限制了其進一步應用。人肺類器官不僅包含多種類型的人肺細胞，其培養過程也需要細胞外基質，符合肉芽腫的形成條件。若將免疫細胞與人肺類器官共培養，引入MTB感染人肺類器官后建立體外肉芽腫模型，比現有體外肺結核模型更具有代表性，更有助于探索肺結核病的發病機制。

3.2.2 與其他先進技術結合用于肺結核病機制研究

由于體外模型可操作程度高，將肺類器官與其他先進技術結合可能產生1+1＞2的效果。CRISPRCas9系統是一種功能強大的基因編輯工具，可與人肺類器官高效結合。一方面，它可對MTB進行基因編輯，如敲除MTB上某藥物潛在靶點，在人肺類器官疾病模型上驗證該藥物的效果［48］；另一方面，它也可對類器官進行基因編輯，基因編輯后的類器官可用于驗證該基因對于MTB感染的必要性，并找到相應治療靶點。類器官結合數學和計算模型實現跨學科應用，可輕松實現疾病模型數據收集并進一步改良，以用于快速且高效篩選干預措施［49］。

單細胞測序（single-cell sequencing）技術作為一種當今最為先進的組學技術之一，可用于研究細胞異質性。例如，Han等［35］通過單細胞測序技術對感染SARS-CoV-2后的肺類器官細胞群進行鑒定，其中特異表達血管緊張素轉換酶2的肺泡Ⅱ型上皮細胞能夠被SARS-CoV-2感染，并由此進一步篩選了多種血管緊張素轉換酶2的抑制劑，有望成為新型冠狀病毒感染肺炎（COVID-19）治療的新策略。可見，單細胞測序技術與人肺類器官結合，有利于對MTB與人類宿主的相互作用機制進行深度探索。

3.2.3 共病研究

結核病的發展與許多個體因素有關，如糖尿病、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）合并感染、吸煙和酗酒等［50］。糖尿病是活動性和潛伏性肺結核發病的主要危險因素，導致患者對結核病易感性增加［51］；HIV合并感染也是發生活動性結核病的重要風險因素，增加了原發性感染或再感染的易感性［52］。共感染的病原體之間相互促進或抑制的程度取決于其共同感染的物種，而物種間的種屬差異性導致病情的嚴重程度不同，進而對治療決策產生干擾［53］。而使用來自不同個體（不同遺傳背景及合并癥的潛在感染者）的成體干細胞衍生的肺類器官，是開展結核病與其他疾病共病機制研究的極佳平臺。個體化人肺類器官可對MTB與宿主的相互作用進行深刻剖析，從而為個體化治療開辟新途徑［2］。此外，人iPSC衍生的肺類器官依然能夠保留源個體的特征，如遺傳多樣性、年齡、代謝狀態和突變標志等［54-55］。因此，將某個患者的iPSC衍生的肺類器官和免疫細胞共培養搭建的肺結核模型，能夠最大程度地反映具有個體特點的病原體與宿主相互作用和治療的差異性，成為開發呼吸道感染性疾病個性化治療方法的有力工具。

3.2.4 抗結核藥物篩選

抗結核藥物敏感性試驗對結核病治療至關重要，傳統藥物測試模型主要使用細胞系和動物模型，但兩者在研究MTB感染時有許多局限性。而類器官在非臨床藥物篩查研究方面具備高通量、高特異性的特點［9］，如人腸道類器官用于抗輪狀病毒藥物測試，其有效劑量范圍相比細胞模型與人體測試結果更加接近［56］。此外，據美國食品藥品監督管理局調查數據顯示，即使經過動物實驗檢測確認安全有效后，仍有高達90%的藥物在臨床人體試驗中宣布失敗，而失敗的原因主要是缺乏與預期相符的療效或具有毒性［57］。因此，構建能夠直接預測人類反應的模型系統非常重要，可顯著減少新藥研發的時間和成本。基于人肺類器官建立的肺結核模型，將彌補傳統細胞和動物模型的缺陷，為有效篩選抗結核藥物尤其是針對耐藥菌的抗結核藥物篩選提供新平臺。

4 面臨的挑戰

如上所述，人肺類器官在肺結核病發病機制、耐藥機制和共病研究及抗結核藥物篩選等方面具有巨大的潛力，但同樣也具有其局限性：①目前構建的人肺類器官包含多種肺上皮細胞類型，缺乏內皮細胞、平滑肌細胞和免疫細胞及血液循環，無法重現微環境對感染發生和進展的影響［26］。器官芯片（organ on-chip）技術可以實現免疫細胞遷移和血液流動，模擬氣-液-黏膜界面并再現MTB感染宿主的過程及關鍵病理生理特征，具有更好的臨床一致性［58］。②人肺類器官的培養缺乏標準化方案，從而影響了其在感染性疾病研究中的效果。如使用化學成分不明確或力學結構過于單一的細胞外基質可能會影響細胞行為，包括生長、增殖、遷移和分化等，從而有可能干擾肺結核病機制研究和抗結核藥物高通量篩選的結果［59］。科研人員已經在嘗試開發一些含有特定的生物物理和生化特性的人工合成基質，用以取代各種生物來源的細胞外基質［60］。構建完善的人肺類器官將有助于更加客觀地認識肺結核病的發病機制，成為抗結核藥物開發的高質量平臺，為實現“終止結核病”的目標發揮突出作用。