七葉皂苷鈉通過阻斷TGF-β介導的信號通路對急性肺損傷大鼠肺纖維化和炎癥因子的影響*

黃 桑，林 濤，蒙 凌，王志遠，曾昭智

（1.廣東藥科大學附屬第二醫院/廣州新海醫院，廣東 廣州 510300；2.廣東藥科大學實驗動物中心，廣東 廣州 510006）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指在嚴重感染、休克、創傷等非心源性疾病時，肺毛細血管內皮和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。各種原因引起ALI的發病機制、病理變化和臨床過程較相似，共同病理基礎是：肺泡-毛細血管急性損傷，通透性增強，肺間質淤血、滲出、水腫，肺泡透明膜形成和肺泡萎縮，而造成肺通氣與血比例失調，分流量增加，機體呈低氧血癥、嚴重缺氧狀態，肺部影像學為非均一性的滲出性病變[1-2]。

目前研究方向主要關注于對ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）急性期的療效及機理，而缺乏對抗肺纖維化和炎癥因子干預效果和機理的研究[3]。七葉皂苷鈉為七葉樹果實娑羅子的提取物，其性甘、溫，無毒，入脾、肺二經，有抗炎功效。本課題擬采用七葉皂苷鈉干預性治療，通過阻斷轉化生長因子-β（TGF-β）介導的信號通路檢測急性肺損傷大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）含量變化，了解七葉皂苷鈉對急性肺損傷大鼠血清炎癥因子的抑制作用，了解急性肺損傷后肺纖維化的進程及程度，從而了解七葉皂苷鈉對損傷肺有無肺保護作用，特別是對抑制纖維化有無作用。從而為臨床治療提供可能的新選擇和研究途徑。

1 實驗材料

1.1 實驗動物60只SPF級健康Wistar大鼠，雄性，購于中山大學實驗動物中心，體質量160～200 g。許可證號：SCXK（粵）2015-2001。實驗前對其進行1周的適應性喂養，保證大鼠可自由進食、飲水，維持正常的晝夜規律，設置環境濕度50%左右，溫度24℃左右。大鼠所用飼料為標準飼料。

1.2 試劑與藥物 強的松由仙琚制藥股份有限公司生產，全稱：醋酸潑尼松片，批號：150465，片劑，規格：5 mg；七葉皂苷鈉注射液：山東綠葉制藥有限公司，批號：160404708，規格：5 mg；IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、PCⅢ、TGF-β ELISA檢測試劑盒：上海哈靈生物科技有限公司，批號：201711；油酸：天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2016110142；10%中性福爾馬林：廣州化學試劑廠，批號：20150722。TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（AR1002）（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 儀器FA2004B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司），HZT-A1000電子天平（廈門華志科學儀器有限公司），SB3200型超聲波清洗機（必能信超聲上海有限公司），RM23235輪轉石蠟切片機（德國徠卡儀器有限公司LEICA），AE2000倒置顯微鏡（廈門麥克奧迪實業集團有限公司）、HCP246恒溫培養箱（德國美墨爾特有限公司Memmert），3K15冷凍離心機（德國希格瑪實驗室離心機公司Sigma Laborzentrifugen GmbH），Infinite 200 pro酶標儀（瑞士帝肯有限公司TECAN），全自動生化分析儀Roche Hitachi917型（日本奧林巴斯株式會社Olympus），血氣分析儀（美國雅培有限公司ABBOTT），Forma902超低溫冰箱（美國賽默飛世爾公司Thermo Fisher）。

2 方 法

2.1 分組與造模 根據實驗目的將大鼠隨機分為4組：空白組、模型組、陽性對照組、實驗組（七葉皂苷鈉組）。給藥方法：空白組經尾靜脈注射生理鹽水0.13 mL/kg作為正常對照，模型組、陽性對照組、實驗組分別給予注射油酸0.13 mL/kg，12 h后經尾動脈取血0.2 mL，立即用手持式血氣分析儀行血氣分析并打印結果，以氧合指數（PaO2/FiO2）≤300為造模成功[4]。

2.2 實驗給藥 模型成功后實驗組經尾靜脈注射七葉皂苷鈉注射液（4 mg/kg），空白組、模型組注射生理鹽水（2 mL/kg），陽性對照組按照3.6 mg/kg的劑量給予強的松，1次/d，連續14 d，期間對大鼠活動、飲食及體重密切觀察。分別于給藥后第14 d處死各組大鼠，并按設計要求留取標本。

2.3 觀察指標

2.3.1 大鼠肺纖維化的生理指標 測量各鼠體質量，然后用剪刀先剪去劍突處鼠毛，用酒精消毒皮膚，以3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，持5 mL注射器針頭行向上進針刺入心臟采血5～6 mL，離心后取血清保存至-20℃冰箱內。取肺組織：打開胸腔，分離肺組織，予電子天平稱重測量。切取右肺在生理鹽水中漂洗干凈，置于甲醛溶液中固定，后經脫水、透明、浸蠟和包埋等制作成石蠟組織塊和切片。

2.3.2 大鼠肺組織HE染色檢查 石蠟切片后HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織結構變化。

2.3.3 大鼠肺泡灌洗中炎癥因子水平 檢測肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10，檢測方法主要參照試劑盒說明書。

2.3.4 大鼠肺組織信號通常分子蛋白的表達 肺組織采用免疫組化法，觀察空白組、模型組、實驗組3組大鼠肺組織轉化生長因子β（TGF-β）、Smad蛋白2（Smad2）、Smad蛋白3（Smad3）、α-平滑肌肌動蛋白（α-sma）表達。

2.4 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件，計量資料符合正態分布以（±s）表示，采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05時表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠肺纖維化的生理指標比較 空白組大鼠外觀基本正常，肺組織為粉紅色，肺泡彈性良好；模型組大鼠肺組織部分呈現灰白色，實驗組與陽性對照組大鼠肺臟顏色較模型組紅潤。模型組大鼠的肺系數、炎癥程度、纖維化程度均高于其他3組（P＜0.05）。陽性對照組與實驗組大鼠的的肺系數、炎癥程度、纖維化程度均高于空白組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；陽性對照組與實驗組大鼠的肺系數、炎癥程度、纖維化程度對比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肺纖維化的生理指標比較（±s）

表1 各組大鼠肺纖維化的生理指標比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別 肺系數（mg/g） 炎癥程度 纖維化程度空白組 0.46±0.05a 1.09±0.07a 0.17±0.04a模型組 1.31±0.29 3.51±0.33 6.75±0.79陽性對照組 0.49±0.07a 1.62±0.20a 0.12±0.03a實驗組 0.52±0.11a 1.71±0.21a 0.18±0.10a

3.2 各組大鼠肺組織HE染色檢查結果HE染色檢查顯示：空白組大鼠肺泡壁較薄，具有完整的肺泡結構，未發現炎癥細胞浸潤或充血等情況；模型組大鼠肺泡壁變厚，眾多肺泡出現塌陷，部分可見融合成大肺泡，肺泡中具有明顯的炎癥細胞浸潤或充血等情況；陽性對照組與實驗組大鼠的炎癥程度相較于模型組顯著減輕，與空白組則無明顯差異；陽性對照組與實驗組大鼠的仍可保持肺泡結構尚，但肺泡間隔存在局部變厚，肺泡較少存在融合。（見圖1）

圖1 各組大鼠HE染色檢查結果（×400）

3.3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較 陽性對照組、實驗組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10均低于模型組（P＜0.05）。實驗組大鼠肺泡灌洗液中，IL-6明顯低于陽性對照組（P＜0.05），兩組大鼠其它指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（±s，ng/mL-1）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（±s，ng/mL-1）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05

組別 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10空白組 77.39±15.32a 201.57±18.24a 102.47±17.49a 93.38±15.76a模型組 105.31±18.27221.71±25.47 127.16±19.83123.58±19.83陽性對照組89.75±16.57a 211.45±21.80a 114.47±15.81a 91.74±16.86a實驗組 92.48±16.41a 210.07±20.94a 98.89±13.43a b 90.59±15.27a

3.4 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表達比較 模型組大鼠肺組織TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表達均高于空白組（P＜0.05），而實驗組大鼠肺組織均低于模型組（P＜0.05）。（見圖2～5，表3）

表3 各組信號通路分子蛋白的表達（±s）

表3 各組信號通路分子蛋白的表達（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別 TGF-β Smad2 Smad3 α-sma空白組1.521±0.202a 1.675±0.267a 1.538±0.287a 1.435±0.219a模型組3.175±0.4593.899±0.564 3.873±0.743 2.849±0.513實驗組1.784±0.243a 2.243±0.0.471a 2.476±0.372a 1.998±0.234a

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β免疫組化染色結果（×400）

圖3 各組大鼠肺組織Smad2免疫組化染色結果（×400）

圖4 各組大鼠肺組織Smad3免疫組化染色結果（×400）

圖5 各組大鼠肺組織α-sma免疫組化染色結果（×400）

4 討論

ALI和ARDS是導致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭的重要原因。它們共同病理基礎是：肺泡-毛細血管急性損傷，通透性增強，肺間質淤血、滲出、水腫，肺泡透明膜形成和肺泡萎縮，而造成肺通氣與血比例失調，分流量增加，機體呈低氧血癥、嚴重缺氧狀態[5-6]。

在急性肺損傷早期，機體通過激活中性粒細胞、巨噬細胞，以及其產生的炎癥因子直接作用于肺泡膜而引起肺損傷。有研究[7]表明，ALI/ARDS時，炎癥介質大量產生并相互作用，形成網絡，且斷循環促進，形成“瀑布樣”反應，血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量明顯增高。現研究已證實ALI和ARDS是由多種炎性介質及效應細胞共同參與的結果，雖然激素的規范化在炎癥早期發揮著重要作用，但其最終治療效果并不理想，死亡率依舊高居不下，不僅因為疾病進展過程迅速，而且其內在的發病機制至今尚無統一定論[8]。

肺纖維化形成是炎癥因子通過作用下黏附于肺毛細血管內皮，其微血管通透性增高，進而導致肺泡滲出中富含蛋白質肺水腫及透明膜形成，同時伴有肺間質纖維化，而肺纖維化可能是導致肺功能受損的關鍵。肺纖維化病理過程主要包括早期損傷、炎癥免疫反應、成纖維化3個階段，雖然纖維增殖是正常的修復過程，但如果不及時干預可能會產生嚴重后果[9]。在細胞水平及動物模型的研究中發現，肺纖維化起源于肺損傷并伴之發展，因此在肺損傷早期實現肺纖維化形成干預，可有效的延緩及控制肺纖維化的形成。在此過程中除了涉及到巨噬細胞、中性粒細胞外，還與多種細胞因子及趨化因子密切相關，如TGF-β、TNF-α、白細胞介素（IL）、血小板源性生長因子（PDGF）、結締組織生長因子（CTGF）、基質金屬蛋白酶（MMPs）[10]。

已有研究[11-13]表明，TGF-β通過Smads通路信號轉導來實現肺纖維化中I型膠原蛋白的轉錄和蛋白表達的調控，不僅如此，TGF-β還可通過調節MMPs、TIMPs等的表達實現對肺纖維化過程的調節。由此可見，TGF-β致纖維化形成過程的關鍵性纖維化因子，通過阻斷TGF-β介導的信號傳導通路中的某些環節來治療或減緩肺纖維化疾病已成為人們最近研究的熱點。羥脯氨酸（HYP）是機體膠原蛋白的主要成分之一，為膠原纖維所特有，其含量的變化可作為衡量膠原組織代謝的重要指標，可判斷纖維化的程度[14]。

七葉皂苷鈉能促進機體產生ACTH和COR，促進血管壁分泌PGF，具有類糖皮質激素抗炎、抗滲出、消腫脹作用，其能穩定血管內皮細胞和清除氧自由基，提高靜脈張力，促進淋巴回流，改善微循環等，而用于治療多種臨床疾病[2]。劉朝普等[15]研究七葉皂苷鈉對油酸制備急性肺損傷大鼠模型的療效觀察，通過檢測PaO、W/D、血漿及肺勻漿中SOD、MDA等，結果表明不同劑量七葉皂苷鈉對急性肺損傷模型大鼠均有抗炎、抗滲出作用。也有研究表明，七葉皂苷鈉可顯著抑制機體炎癥遞質的產生，清除急性肺水腫，在創傷性急性肺損傷早期應用治療效果明顯。亦有研究[16]表明，七葉皂苷鈉能有效預防嚴重急性放射性肺損傷，而無激素類不良反應，且能提高患者生活質量。目前研究方向主要關注于對ALI/ARDS急性期的療效及機理，而缺乏對ALI/ARDS遠期（即ALI后期，抗肺纖維化）干預效果和機理的研究[17]。

本課題采用七葉皂苷鈉干預性治療，通過檢測急性肺損傷大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量變化，發現陽性對照組、實驗組血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10均低于模型組（P<0.05）。實驗組大鼠肺泡灌洗液中，IL-6明顯低于陽性對照組（P<0.05），說明七葉皂苷鈉干預性治療明顯降低其炎性因子水平。通過本次對大鼠肺系數、炎癥程度、纖維化程度的觀察說明七葉皂苷鈉能對大鼠肺纖維化的生理指標產生積極的影響，這與娑羅子的抗炎、消腫功效相吻合。HE染色檢查顯示空白組大鼠肺泡壁較薄，模型組大鼠肺泡壁變厚，眾多肺泡出現塌陷，而陽性對照組與實驗組大鼠的炎癥程度相較于模型組明顯減輕，與空白組則無明顯差異；陽性對照組與實驗組大鼠的仍可保持肺泡結構尚，但肺泡間隔存在局部變厚，肺泡較少存在融合。Masson染色檢查也顯示模型組大鼠雙肺喪失了絕大部分肺泡結構，可見藍色膠原大量沉積于間質，肺部實變，其纖維化程度相較于陽性對照組和實驗組大鼠明顯增加；陽性對照組與實驗組大鼠肺泡間隔的膠原沉積情況較輕，其纖維化程度與空白組相比無明顯差異。這都說明七葉皂苷鈉對大鼠肺纖維化產生了積極的療效。

大量研究[18]表明，肺纖維化的發生機制主要與早期的炎癥反應和隨后的纖維化增生有關。TGF-β信號通路是介導炎癥反應的重要因素，很多抗肺纖維化治療的藥物都以該通路及通路中的重要分子蛋白Smad2、Smad3、α-sma表達密切相關[19]。本研究以信號通路TGF-β及關鍵分子蛋白Smad2、Smad3、α-sma為檢測指標，發現模型組大鼠肺組織TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表達均高于空白組（P<0.05），而實驗組大鼠肺組織中蛋白表達均下降（P<0.05）。說明七葉皂苷鈉對TGF-β信號通路有明顯阻攔作用。

綜上，七葉皂苷鈉能明顯改善大鼠肺纖維化的生理指標，降低肺纖維化模型大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平，能明顯抑制TGF-β/Smad信號通路，為臨床治療急性肺損傷提供了新的選擇和研究途徑，但其治療機制需進一步研究。