擬南芥CGP1基因啟動子克隆及其GUS轉基因植株的構建

朱香豫, 吳 席, 陶曼芝, 王婷婷, 賈亞峰, 曹樹青

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

隨著現代化工業的發展,大量廢棄物隨之排放至外界環境中,其中不免會有一些有毒害的重金屬廢棄物,最終會造成土壤中重金屬污染,這也成為當代農業科學的研究熱點之一[1]。由于人類活動頻繁導致重金屬污染,最終造成生態環境惡化,其中重金屬鎘污染對農作物的生長危害極大,且具有生物累積性[2-3]。農作物中的鎘通過食物鏈傳遞最終會累積至人體內,引起一系列生理疾病,如心血管疾病、高血壓等[4]。鎘對植物的危害本質上是由于鎘離子(Cd2+)會導致活性氧代謝失衡,損害細胞膜結構,從而使其生理代謝發生紊亂。

植物在受到鎘脅迫時引起信號轉導,包括激發對鎘攝取、轉運和解毒的相關基因表達、合成與逆境相關的蛋白和分子信號,通過復合調控網絡來適應和降低自身受到的鎘毒害水平[5]。因此通過植物轉基因技術使重金屬富集到植物體中從而改善土壤重金屬污染問題，是目前最經濟有效且前景廣闊的植物修復技術[6]。為探究基因CGP1在擬南芥中響應重金屬鎘脅迫的作用,本文通過克隆CGP1基因啟動子,構建CGP1啟動子接GUS載體的轉基因材料,以研究CGP1基因的表達模式和響應鎘脅迫的表達變化,為探究CGP1基因的功能及其在響應鎘脅迫中的信號通路奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

植物材料是生態型為哥倫比亞(Columbia,Col) 遺傳背景的野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana),購于美國擬南芥種質資源中心(TAIR),后由本實驗室繁殖所得;載體質粒為pART27(GUS載體)大腸桿菌DH5α,農桿菌GV3101。

1.1.2 主要試劑

San Taq PCR Mix (Sangon Biotech-B639295), Prime STAR Max Premix (TaKaRa-#R045), 限制性核酸內切酶HindⅢ(NEB-#R3104V),KpnⅠ(NEB-#R3142V), T4-DNA Ligase(NEB-#M0202S), dNTP Mixture Solution (Sangon Biotech-A610056), TIAN prep Mini Plasmid Kit(TIANGEN-DP103), TIANgel Midi Purification Kit (TIANGEN-DP209), DNA marker (TransGen-BM101), Tris-HCl(1185-53-1), NaCl(7647-14-5), EDTA(60-00-4), SDS(151-21-3), GUS Blue KIT(華越洋GT0391-50), 異丙醇(67-63-0),無水乙醇(64-17-5),1/2Murashige Skoog(Caisson-MSP08)等。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養

配制營養土,將黑土高溫高壓滅菌20 min后進行人工粉碎,按照珍珠巖、黑土、蛭石體積比為1∶3∶9的比例混合均勻裝入土培盆,再放到托盤中浸透營養液,最后用潤濕的牙簽沾取種子進行點種。

1.2.2 擬南芥全基因組DNA的提取

取培養2周后的野生型擬南芥葉片,與玻璃珠一起放入1.5 mL EP管中，經液氮研磨充分后加入400 μL DNA提取液(SDS)后劇烈混勻,12 000 r/min、 4 ℃下離心10 min,吸取200 μL上清于新的離心管中,加入等體積異丙醇溶液翻轉混勻后12 000 r/min室溫離心10 min,除去上清液，再加800 μL 70%乙醇,12 000 r/min離心5 min洗去雜質去上清,將沉淀放在通風櫥下吹12 min,沉淀吹干后加入35 μL無菌雙蒸水,-20 ℃冷凍保存。

1.2.3 克隆CGP1啟動區基因片段及酶切連接

在TAIR網站上查詢擬南芥CGP1基因的啟動子序列,長度為2 000 bp,利用Oligo7.0軟件設計以下引物進行CGP1啟動子區域克隆:ProCGP1-FP:5’-GGGGTACCTTCTTCTGCATTATTGTCGC-3’;ProCGP1P-R:5’-CCCAAGCTTCTAGAGATGAGAATCCATG-3’。

該引物酶切位點為KpnⅠ、HindⅢ,模板為擬南芥全基因組DNA。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)體系為25 μL,采用的Prime STAR Max Premix為高保真DNA聚合酶,其擴增效率為1 000～2 000 bp/min,PCR反應條件為:98 ℃預熱5 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min,擴增36個循環;72 ℃延伸5 min。將擴增出來的啟動子片段以及pART7-GUS質粒用限制性核酸內切酶KpnⅠ、HindⅢ雙酶切后用T4-DNA Ligase在16 ℃連接10～14 h。

1.2.4 大腸桿菌熱激轉化

低溫取出大腸桿菌DH5α,冰上解凍后加5 μL連接產物輕輕混勻,冰浴30 min后進行水浴42 ℃熱激60 s,再放置冰上,2 min后加600 μL LB培養基放入搖床培養1 h。菌液渾濁后涂布在加有壯觀霉素抗性的LB固體培養基上,然后進行挑菌鑒定、測序和提取質粒。

1.2.5 電擊轉化農桿菌及浸染花序

將農桿菌感受態細胞GV3101置于冰上解凍,取2 μL測序結果比對正確的ProCGP1-GUS重組載體質粒,加到感受態細胞中輕輕混合,再吸取至提前預冷的1 cm電擊杯中,放入電擊儀在電脈沖5 μF、電壓1 800 V條件下電擊2次,再培養搖菌涂布到含有慶大霉素和壯觀霉素雙抗性LB平板上,2 d后挑單克隆菌落培養,PCR鑒定后接種于含有慶大霉素和壯觀霉素雙抗性LB液體培養基中,培養至OD600為1.0～1.4,高速離心去上清后加入侵染緩沖液重懸菌體,使菌體OD600為0.8～1.0,最后加SilwettL-77使其終體積分數為0.02%,顛倒混勻待用。選取5～6周的已結出花序和長角果的野生型擬南芥避光侵染花序,侵染前提前剪去果莢,黑暗處理12 h后光照培養,1周后不剪果莢再次侵染。

侵染緩沖液配方如下:1/2MS培養基用量為0.218 g;sucrose用量為6 g;SilwettL-77用量為25 μL;ddH2O定容至100 mL。

1.2.6 轉基因陽性植株的鑒定

收取侵染后成熟的擬南芥種子記為T0代,經0.1%HgCl2殺菌消毒后撒在含有卡那霉素抗性的1/2MS固體培養基中進行篩選,培養10 d左右后移栽葉片深綠且根長的幼苗到營養土里,提取DNA經PCR鑒定正確后,得到轉基因陽性植株,再經過后期性狀分離純化得到純合體種子。

2 結果與分析

2.1 啟動區基因片段克隆

為探究CGP1基因在擬南芥中響應重金屬鎘脅迫的作用,構建ProCGP1-GUS重組載體。取野生型擬南芥種子播種于營養土中,于溫室中培養4周后取其蓮座葉用SDS法提取擬南芥全基因組DNA,以此DNA作為模板,使用引物ProCGP1-FP、ProCGP1-RP以及高保真DNA聚合酶進行PCR序列擴增,完成后在PCR產物中加入Loading Buffer進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖1所示。

從圖1可以看出，條帶大小約2 000 bp,與所選取的啟動子區域長度一致。

2.2 載體和目的片段雙酶切

選用GUS載體上所包含的酶切位點,而在ProCGP1片段上不含相應酶切位點堿基序列的2個限制性核酸內切酶KpnⅠ和HindⅢ對載體pART7-GUS和ProCGP1進行共同雙酶切。酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,如圖2所示,圖2中,M1為2 000 bp Marker;M2為10 000 bp Marker。由圖2可知,酶切后的目的基因條帶和載體質粒清晰，且大小與實際相符。

2.3 重組載體轉化大腸桿菌后陽性克隆鑒定

將酶切后的載體質粒和基因片段進行膠回收,測回收產物DNA質量濃度,按照質粒與目的片段質量比約1∶3的比例通過T4-DNA Ligase連接,10 μL體系16 ℃連接10～14 h。吸取5 μL連接產物,采用熱激轉化法轉入到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,然后挑取單克隆菌落到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中,培養完成后進行菌落PCR鑒定,結果如圖3所示,圖3中,M為2 000 bp Marker;1～9分別代表轉化后大腸桿菌的PCR條帶。由圖3可知,1、3、7、9號菌落PCR條帶與CGP1基因啟動子片段大小一致,選取3號菌進行測序,測序結果經過DNAMAN軟件序列比對后發現與CGP1基因啟動子序列吻合,表明ProCGP1-GUS載體構建成功。

2.4 ProCGP1-GUS載體轉化農桿菌及侵染

選取測序正確的ProCGP1-GUS載體質粒通過電擊轉化法轉入農桿菌GV3101感受態細胞,2 d后挑取可以生長在慶大霉素和壯觀霉素雙抗性LB培養基上的菌落進行PCR鑒定,鑒定結果如圖4所示,圖4中,M為2 000 bp Marker;1～9分別代表轉化后農桿菌單菌落的PCR條帶。從圖4可以看出,1、4、6、7、9號菌落PCR條帶與CGP1啟動子基因片段大小一致,選取7號陽性菌通過浸花法侵染擬南芥花序,1周后再次侵染,以提高轉基因效率。

2.5 轉基因陽性植株的獲取

收取侵染后的擬南芥種子置于室溫中干燥處理7 d,隨后置于4 ℃條件下春化3 d。種子經0.1%氯化汞消毒沖洗后撒在含有50 μg/mL 卡那霉素抗性的1/2MS培養基上,置于22 ℃培養箱中培養2周,觀察種子萌發和生長狀態,陽性植株因其含有卡那霉素抗性基因,因此可以在含有卡那霉素抗性的培養基上生長,而未構建成功的則會表現為不發芽和葉片黃化的狀態,抗性篩選結果如圖5所示。

將生長正常且根長、葉綠的幼苗移栽至營養土中,將其置于22 ℃恒溫氣候培養室中光照培養。約4周后提取篩選獲得的陽性植株DNA進行PCR鑒定,鑒定結果如圖6所示,圖6中,M為2 000 bp Marker。由圖6可知，篩選的植株均為ProCGP1-GUS轉基因陽性植株。

陽性植株逐代繁殖單株收種后點在含有50 μg/mL卡那霉素抗性的1/2MS培養基上,培養2周后,植株如圖7所示。

由圖7可知,野生型植株(WT)葉片萎黃或不發芽,而ProCGP1-GUS轉基因植株葉綠根長且生長狀態正常,因此可以初步確定為純合體植株。

3 討 論

土壤重金屬污染日益嚴重,尤其是重金屬鎘毒害作用較強,且可以在植物的不同部位累積,當累積重金屬的植物進入生態循環中,最終會危害人類身體健康[7-9]，因此研究植物對鎘脅迫的響應機理對于修復土壤和農業生產方面影響深遠[10]。而植物如何感受外界環境變化以及響應重金屬脅迫,并對自身生長發育進行相應的系統調控并不完全明確[11]。隨著分子生物學領域的發展,通過基因克隆和重組的方法來研究重金屬鎘相關基因的功能及其表達模式具有重要意義。本研究通過基因工程技術和分子遺傳學手段獲得了擬南芥ProCGP1-GUS轉基因植物的純合體材料,并利用GUS報告基因的特性來研究基因CGP1在植物組織中的表達。同時構建的轉基因ProCGP1-GUS陽性植株為后續闡明CGP1基因的功能及其在響應鎘脅迫中的作用提供了依據。