基于全二維氣相色譜-四級桿飛行時間質譜高通量檢測青花椒揮發(fā)性香氣成分

向章敏，劉恩剛

(1.廣東省科學院測試分析研究所 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣州 510070；2.貴州大齊嶺生態(tài)農業(yè)有限公司，貴州 銅仁 555101)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)作為“八大調味品”之一，是一種我國特有且資源豐富的調味品及中藥原料，具有特殊麻感和濃烈香味[1]。青花椒(Zanthoxylumarmatum)來源于蕓香科植物青椒樹的干燥成熟果皮，是我國種植面積最大的花椒種屬之一，也是老百姓生活中最常用的食用香辛料[2]，其中的香氣自然就成為評判其品質優(yōu)劣的重要指標。青花椒中的香氣物質是能對人的嗅覺(氣味)產(chǎn)生刺激而獲得某種感覺的物質，帶給食品芳香的氣味，是評價花椒質量和特色的重要指標[3]，同時青花椒中的揮發(fā)性有效成分具有溫中行氣、逐寒、止痛、殺蟲、抗腫瘤、麻醉等功效[4]。因此，檢測青花椒揮發(fā)性香氣物質顯得尤為重要。目前，一維氣相色譜是檢測花椒香氣成分最常見的分析方法，如王花俊等[5]利用氣相色譜-質譜法對不同提取方法獲得的花椒揮發(fā)性香味成分進行了檢測與分析；魏泉增等[6]采用氣相色譜-質譜法分析了5個不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性成分；蒲鳳琳等[7]用水蒸氣蒸餾結合氣相色譜-質譜法分析比較了四川漢源青、紅花椒揮發(fā)性香氣成分；Sun等[8]采用香氣萃取稀釋結合氣相色譜-質譜聯(lián)用技術與氣相色譜-嗅覺法鑒定了四川漢源和陜西韓城兩個地區(qū)的花椒油中的主要香氣活性化合物。然而，一維氣相色譜往往出現(xiàn)峰容量不足、峰共流出、物質干擾嚴重等問題，很難實現(xiàn)高通量色譜分離與準確鑒定。全二維氣相色譜由于實現(xiàn)了將分離機理不同而又相互獨立的兩根色譜柱以正交方式相組合，極大地提高了色譜的分離能力和分析速度，彌補了傳統(tǒng)一維氣相分離峰容量不足的缺點，是實現(xiàn)高通量復雜成分色譜分離的強有力工具[9]。因此，本文基于頂空固相微萃取與全二維氣相色譜-四級桿飛行時間質譜相結合的方法，建立了一種高通量檢測青花椒揮發(fā)性香氣成分的分析方法，該方法簡單、快速、準確地實現(xiàn)了青花椒香氣成分檢測，為青花椒香味客觀評價、風味產(chǎn)生機理、質量品質分析等相關領域的研究提供了科學方法和物質基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890B-7250氣相色譜-四級桿飛行時間質譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；SSM1800固態(tài)熱調制器 雪景科技公司；PAL RSI120三合一自動進樣器 瑞士CTC公司；FW80研磨儀 天津泰斯特儀器有限公司；ND100-1氮吹儀 杭州瑞誠儀器有限公司；AL-104電子天平 美國Mettler-Toledo公司；ZNHW-Ⅱ電熱套 鞏義市予華儀器有限責任公司；其他常用玻璃儀器。

甲醇、正己烷：色譜級，美國Merck公司；無水硫酸鈉：分析純，廣州化工集團有限公司；超純水：自制；正構烷烴標準品：C10～C25，純度>99.5%，Sigma-Aldrich Fluka公司；內標乙酸苯乙酯：純度>99.6%，Sigma-Aldrich Fluka公司。

1.2 樣品材料

試驗樣品由貴州大齊嶺生態(tài)農業(yè)有限公司提供。樣品分別來源于貴州石阡縣、云南昭通市和四川瀘縣，品種均為九葉青花椒。

1.3 儀器分析條件

氣相色譜條件：色譜柱組合為HP-WAX(5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷，30 m×0.25 mm，0.25 μm)和DB-17MS(50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷，1.0 m×0.180 mm，0.18 μm)；進樣口溫度為250 ℃；不分流進樣；程序升溫為50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至240 ℃并保持3 min；恒流模式，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。

調制器條件：冷區(qū)溫度設置為-50 ℃，進入熱區(qū)和離開熱區(qū)的溫度相對于柱溫為偏差+30 ℃和+120 ℃，兩個熱區(qū)的上限溫度均為320 ℃；調制周期為4 s。

質譜條件：離子源為 EI,70 eV；離子源溫度為200 ℃；四級桿溫度為150 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；質量范圍為45～400 m/z；采集速率為50 Hz。

1.4 前處理方法

本文采用頂空固相微萃取(HS-SPME)方法對青花椒揮發(fā)性香氣成分進行前處理[10-11]。將樣品在冷凍干燥后研磨成粉狀，過60目篩，隨后稱取0.0500 g粉末置于20 mL頂空樣品瓶中，同時加入一定量的乙酸苯乙酯內標，用頂空瓶蓋將其密封，然后將頂空瓶放入固相微萃取裝置中加熱，在60 ℃條件下平衡20 min，利用固相微萃取纖維頭(PDMS/DVB/CAR)吸附20 min，最后在250 ℃進樣口解吸5 min進行全二維氣相色譜分離。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

化合物定性鑒定是與NIST標準譜庫(NIST/EPA/NIH 2017)進行匹配，選擇正、反匹配因子均高于800的化合物，同時使用保留指數(shù)和精確質量數(shù)對化合物作進一步確認[12-13]。定量方法是根據(jù)內標相對含量進行半定量分析[14]。采用Canvas(V1.8.0，J & X Technologies)數(shù)據(jù)處理軟件進行全二維數(shù)據(jù)處理。

2 結果與討論

2.1 全二維色譜分離效果

全二維氣相色譜技術(comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC)由于實現(xiàn)了分離機理不同而又相互獨立的兩根色譜柱以正交方式相組合的色譜分離模式，極大地提升了色譜的分離能力和分析速度，彌補了傳統(tǒng)一維氣相分離峰容量不足的缺點，是實現(xiàn)高通量檢測的強有力工具[15]。因此，色譜柱的組合是實現(xiàn)正交分離的關鍵因素，直接影響復雜化合物的分離效果。對于大多數(shù)香氣物質分析而言，一維色譜柱通常為極性柱，組分會依據(jù)極性順序出峰，二維色譜柱為中等極性或弱極性柱，組分會按照揮發(fā)性及官能團順序出峰。本文選擇了HP-WAX極性柱作為第一維色譜柱，選擇DB-17中等極性柱為第二維色譜柱，其全二維色譜分離結果見圖1。

圖1 青花椒揮發(fā)性香氣成分的全二維氣相色譜圖

由圖1可知，一維氣相色譜(one-dimensional gas chromatography，1-DGC)分離存在部分共流出現(xiàn)象。由圖1選中的區(qū)域可以看出，1-DGC僅檢測到2個峰，分別為大根香葉烯和γ-古蕓烯，而GC×GC在相同保留時間上進一步分離之后又得到另外3個峰，分別是檸檬醛、橙花醇乙酸酯、4-(3,4-二甲氧基苯基)-4-哌啶醇。因此，由1-DGC和GC×GC分離對比可以看出，GC×GC的正交分離可使得色譜峰容量極大地提高，從而實現(xiàn)青花椒揮發(fā)性香氣物質的高通量檢測，其中包括文獻[16-17]在1-DGC分析中未報道的微量成分。此外，對于性質類似的有機化合物一般都具有相同的化學結構，如相同的化學基團、芳香環(huán)、雙鍵等，在全二維氣相色譜分離中，可以實現(xiàn)對同系物、異構體、同類組分等族分離效果。本文對不同萜類物質分析過程中，發(fā)現(xiàn)單萜、倍半萜及含氧萜類在全二維色譜圖上具有較好的族分離效果，見圖2。

圖2 萜類物質族分離效果圖

由圖2可知，單萜、倍半萜及含氧萜類在全二維色譜上具有較好的族分離效果，其中根據(jù)揮發(fā)性，單萜出峰時間相比含氧萜烯和倍半萜要快。其次，從極性來看，含氧萜烯比單萜和倍半萜略強一些，所以在二維柱上會比單萜和倍半萜略為靠近下端。因此，本文所使用的色譜柱組合對青花椒香氣成分中的萜類物質具有較好的族分離效果。

2.2 定性和定量分析

基于1.5的數(shù)據(jù)處理方法，采用NIST庫檢索，篩選正向、反向匹配度均大于800的化合物，然后通過分子離子峰的精確分子量以及實測保留指數(shù)做進一步化合物結構確認，最終定性鑒定出了75個化合物，并采用乙酸苯乙酯內標相對含量定量方法，對貴州、云南及四川3個地區(qū)的實際樣品進行檢測分析，其分析結果見表1。

表1 青花椒揮發(fā)性香氣成分定性和定量數(shù)據(jù)

續(xù) 表

由表1可知，本文共分析鑒定了青花椒中75種主要揮發(fā)性香氣化學成分。從定性數(shù)據(jù)來看，正向、反向匹配因子均大于800，平均值分別為842和851；保留指數(shù)經(jīng)與文獻比對，偏差值均不超過40；高分辨分子量檢測值與理論值偏差均小于5。綜上，青花椒中75種化合物的定性鑒定結果準確、可靠，符合定性分析要求[18]。

2.3 實際樣品分析

本文采集了不同地區(qū)的青花椒樣品進行實際樣品分析，以乙酸苯乙酯為內標，采用1.4方法對所鑒定的75種青花椒揮發(fā)性香氣成分進行半定量分析，各地區(qū)相對含量分析見表1。定量分析結果表明，青花椒中主要的揮發(fā)性香氣物質為芳樟醇，平均占總揮發(fā)性成分的87.2%以上，其相對含量大小順序為貴州(25.29 mg/g)>云南(12.96 mg/g)>四川(8.58 mg/g)。另據(jù)文獻報道[19]，芳樟醇具有濃青帶甜的木青氣息，似玫瑰木香氣，既有紫丁香、鈴蘭香與玫瑰的花香，又有木香、果香氣息，香氣柔和，輕揚透發(fā)，對青花椒香氣貢獻較大。其次，從化學結構來看，青花椒中揮發(fā)性香氣成分類型主要為萜類物質，其中包括單萜類、倍半萜類及含氧萜類，不同地區(qū)萜類物質含量比較見圖3。

圖3 不同地區(qū)青花椒樣品萜類物質含量

由圖3可知，萜類物質在不同地區(qū)的含量趨勢是一致的，其相對含量大小順序為單萜類>含氧萜類>倍半萜類，貴州地區(qū)的萜類物質含量高于云南和四川。其次，除了比較芳樟醇及萜類物質含量外，本文也對其余含量相對較高的10種物質進行了比較，其比較結果見圖4。

圖4 青花椒主要香氣成分的比較

由圖4可知，除芳樟醇外，其他相對含量較高的香氣成分依次為β-月桂烯、檸檬烯、β-羅勒烯、4-側柏醇、β-水芹烯、檜烯、側柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯，這些成分占揮發(fā)性物質總量的90%以上。根據(jù)不同地區(qū)主要揮發(fā)性香氣物質的含量分析來看，β-月桂烯、β-羅勒烯、4-側柏醇、側柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯在貴州地區(qū)含量較高，β-水芹烯、檜烯在四川地區(qū)含量較高，檸檬烯在貴州和四川地區(qū)含量相當，側柏烯、γ-萜品烯在云南和四川地區(qū)含量相當。綜上，針對本次分析樣本，貴州青花椒香氣成分總量高于云南和四川。

3 結論

本文基于全二維氣相色譜-四級桿飛行時間質譜方法建立了青花椒揮發(fā)性香氣成分的高通量分析方法，并應用于實際樣品分析。與常規(guī)的一維氣相色譜相比，解決了部分峰共流出的問題，并實現(xiàn)了青花椒中萜類香氣物質全二維族分離效果。此外，本文對來自貴州、云南和四川的青花椒樣品進行檢測與分析，共鑒定出75種主要的香氣化學成分，并通過乙酸苯乙酯內標進行相對含量分析，發(fā)現(xiàn)青花椒中的主要揮發(fā)性香氣物質為芳樟醇，平均占比可達87.2%，其次是β-月桂烯、檸檬烯、β-羅勒烯、4-側柏醇、β-水芹烯、檜烯、側柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯等萜烯類物質，且在不同地區(qū)，其含量占比略有差異。本研究為青花椒香味品質分析、物質基礎解析、綜合利用等相關領域提供了科學方法和數(shù)據(jù)參考。