獼猴桃潰瘍病病菌的多樣性及其檢測技術

胡施祺， 戴德江， 羅金燕， 朱潔， 安千里， 李斌*

(1.浙江大學 生物技術研究所，浙江 杭州 310058； 2.浙江省植保檢疫與農藥管理總站，浙江 杭州 310020；3.上海市農技推廣中心， 上海 201103； 4.溫州市植物保護與土壤肥料管理站，浙江 溫州 325000)

獼猴桃細菌性潰瘍病最早于20世紀80年代在美國加利福尼亞州[1]和日本神州靜岡縣[2-3]被發現，目前在美國、日本、法國、新西蘭、韓國、伊朗、意大利、葡萄牙和智利等國家以及中國陜西、安徽、重慶、四川、湖北、湖南、河南和河北等地區均有發生，具有擴展快、危害重、防治難等特點，嚴重影響獼猴桃的產量及果實質量，給世界獼猴桃產業造成了嚴重的經濟損失[4]。中國、美國、新西蘭等國以及歐洲植物保護組織都已將獼猴桃細菌性潰瘍病菌列為植物檢疫對象和A2類檢疫性有害生物[5]。丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)被認為是引起獼猴桃細菌性潰瘍病的主要病原菌，該病原菌能夠侵染獼猴桃屬的多種寄主，包括美味獼猴桃、中華獼猴桃、軟棗獼猴桃及狗棗獼猴桃[6]，引起葉斑葉枯、枝干枯裂潰爛、花器萎蔫壞死、皮孔變紅，病處伴隨菌膿分泌等癥狀[7]，造成樹體死亡、果皮變厚、果味變酸、果實變小、果形不一。該病菌的遠距離傳播主要通過進出口的苗木、接穗及花粉等[8]。

為有效遏制獼猴桃細菌性潰瘍病在我國的快速蔓延，建立其主要病原菌的快速、準確、靈敏和方便的檢測方法至關重要。本文綜述了國內外學者對獼猴桃細菌性潰瘍病菌多樣性及檢測技術的研究進展情況，重點分析和比較了各類檢測技術的優劣，為早期有效預防獼猴桃細菌性潰瘍病提供了借鑒。

1 獼猴桃細菌性潰瘍病菌的多樣性

1.1 病原菌的確定

1983年，Opgenorth[1]在美國加利福尼亞州首次發現了獼猴桃細菌性潰瘍病，通過生物學鑒定認為引起該病害的病原為丁香假單胞桿菌。1989年，Serizawa等[2-3]根據形態學、生理生化及致病性試驗發現，1984年在日本靜岡暴發的獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌與丁香假單胞桿菌死李致病變種(Pseudomonassyringaepv.morsprunorum，Psm)及丁香假單胞桿菌丁香致病種(Pseudomonassyringaepv.syringae，Pss)雖相似但存在明顯差異，死李致病變種對梨和日本杏有弱致病性，而對其他24種植株均無致病性，據此認為該獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌是丁香假單胞桿菌屬新的致病種，并將其命名為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Psa)。1993年，朱曉湘等[9]通過生物學方法將我國1986年東山峰農場發生的獼猴桃細菌性潰瘍病的病原菌鑒定為Pss，但隨后意大利[10]、韓國[11]、法國、西班牙[12]、土耳其[13]、斯洛文尼亞[14]、新西蘭[15]及希臘[16]等國的獼猴桃細菌性潰瘍病的病原菌被鑒定為Psa，國內陜西[17-18]、安徽[19]、福建[20]、四川[21]等多地獼猴桃細菌性潰瘍病的病原菌均被鑒定為Psa。目前，對于獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌的鑒定雖還沒有統一結果，但國內外研究人員普遍認為獼猴桃細菌性潰瘍病的病原為Psa[21]。

1.2 遺傳多樣性

Psa菌群具有豐富的遺傳多樣性。2012年，Chapman等[22]利用管家基因、Ⅲ型效應基因和植物毒素基因的多位點序列分析發現，全球至少包括4個具有不同進化軌跡的Psa類群：第一類群Psa1分離自日本，1992年在意大利暴發的Psa，可產生菜豆菌毒素；第二類群Psa2分離自韓國，這一類群均含有能產生冠菌素的質粒，但是不含有產菜豆菌毒素的基因簇[23]；第三類群Psa3為分離自新西蘭特普克地區、智利奧希金斯和毛勒地區、中國陜西省的病原菌，2008年以后在意大利暴發，該類群既不能產生菜豆菌毒素也不能產生冠菌素，具有強致病性，已在全球流行，也被稱為Psa-V[7]；第四類群Psa4為此前流行于維多利亞州和西澳大利亞州的Psa，同樣該類群也不能產生菜豆菌毒素和冠菌素，并且比其他生物群毒力更弱，僅能引起葉斑而不會引起潰爛與枝條枯萎等其他癥狀，生理生化特征也與其他3個類群有明顯差異，該類群可以在KB培養基上產生高強度綠色熒光并能水解七葉苷，第四類群與其他3個類群在檸檬酸合成酶編碼基因(cts)的同源性也低于其他類群與丁香假單胞菌茶樹致病種(Pseudomonassyringaepv.theae，Psth)的同源性[24]，現已被歸為新變種P.syringaepv.actinidifoliorum(Psaf)[25]。2014年，Sawada等[26]在日本佐賀分離到獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌，通過形態特征、生理生化測定、分子檢測、致病性實驗及多位點序列分析鑒定，該病原菌為不同于其他4個類群的新類群，并將該類群命名為Psa5。第五類群目前僅在日本局部地區有報道，該類群與第二類群親緣性較近，但其既不具有第二類群保守的冠菌素合成基因，也沒有日本本土病原菌第一類群保守的菜豆菌毒素合成基因，與其他3個類群組成不同的是該類群基因組中含有45個Ⅲ型分泌效應器基因[27]。

2 目前主要檢測技術

獼猴桃細菌性潰瘍病菌的經典鑒定主要包括田間病害癥狀觀察和病菌的生物學測定等。田間可通過觀察癥狀進行初步鑒定，主要癥狀為枝干病部溢出大量初為乳白色、后變紅褐色的菌膿，上部枝條萎蔫死亡，葉片產生中間為褐色、邊緣為黃色暈圈的近圓形病斑。生物學鑒定主要包括細菌的分離純化、形態觀察等細菌學性狀及生理生化測定[5,9,28]。傳統方法鑒定雖不需要昂貴的儀器設備，但費時費力，而且特異性不高，隨著微生物鑒定方法的不斷發展，免疫學和分子生物學等[29]方法也逐漸應用于獼猴桃潰瘍病菌的檢測。

免疫檢測是利用抗原和抗體的特異性和靈敏性，定量或定性檢測待測物的一種方法。2017年，Cimmino等[30]利用Psa胞外多糖制備抗血清；2018年，Chen等[31]利用Psa3特異性效應蛋白hopz5制備了具有良好特異性的多克隆抗血清PAb∶hopz5，能夠區分Psa3與親緣關系較近的細菌，如丁香假單胞桿菌丁香致病種、茶樹致病種和番茄致病種等；2020年，郭麗倩[5]以獼猴桃細菌性潰瘍病的致病菌株為免疫原，通過雜交瘤技術獲得的3株抗獼猴桃細菌性潰瘍病菌的單抗6C5、14H5和18A4，據此建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法檢測獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測極限分別達到9.0×102和3.6×103mL-1。免疫學檢測雖然快速靈敏，但對抗血清的質量要求較高。隨著分子生物學技術的快速發展，基于PCR的一系列分子檢測技術逐漸被建立起來，這些分子檢測方法更便捷，特異性和靈敏性更高，逐漸成為檢測獼猴桃細菌性潰瘍病的主要方法。雖然針對Psa特異性片段建立的分子檢測方法有諸多優點，但也存在一些應用推廣的缺點(表1)，如需要購買昂貴的配套儀器設備，需要檢測人員具備專業的檢測技術知識等[21]。

表1 獼猴桃細菌性潰瘍病菌主要檢測方法優劣勢比較

3 分子檢測技術及相關引物

傳統的檢測技術由于檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度低、特異性弱已越來越難以適應當前植物檢疫工作的實際需要，基于PCR的分子檢測技術以其快速、簡便、特異性強和靈敏度高等優點在Psa檢測方面得到了大力發展。2002年，Koh等[11]采用隨機擴增多態性技術篩選出Psa特異性片段，并據此設計出引物對KNF/KNR，可以特異地從Psa中擴增出一條492 bp的條帶，使快速、準確診斷由Psa引起的獼猴桃潰瘍病成為可能(表2)。2003年，Jung等[32]基于冠菌素合成編碼基因cfl設計了巢式PCR，能有效檢測第二類群Psa2，其他3個類群因不能合成冠菌素均不能被檢測[33]。2010年，Rees等[34]根據16S-23S rDNA轉錄間隔區設計兩對引物對PsaF1/R2和PsaF3/R4，能分別從Psa特異擴增出一條280 bp和175 bp的條帶，但值得注意的是，丁香假單胞桿菌丁香致病種、茶樹致病種和番茄致病種均能產生假陽性，需輔助明膠液化和對胡蘆巴堿的利用等其他試驗加以區分[34-35]。

表2 已報道用于檢測丁香假單胞獼猴桃致病變種的引物

為進一步提高Psa分子檢測技術的特異性，2011年Gallelli[36]等根據avrD1基因和KN-PCR產物設計了AvrDdpx-F/AvrDdpx-F和KNF/KNR兩對引物進行雙重PCR，可直接快速檢測疑似感染的獼猴桃葉片、花蕾、枝干及花粉組織，而無需進行組織分離和DNA提取，極大減少了檢測步驟和時間[5]；此外，Psth、Pto及Pss等丁香假單胞桿菌相近種均不能產生226 bp和492 bp這兩條特異條帶。2013年，Biondi[37]根據外膜蛋白P1編碼基因ompP1設計了引物B1/B2，并以KNF/KNR為巢式引物進行巢式PCR，雖與其他PCR技術相比在一定程度上提升了反應的靈敏度和特異性，但和KN-PCR及RG-PCR一樣不易區別Psa與Psth、Pto，需進一步通過RFLP分析來區分[37]。邵寶林等[38]通過RAPD分析獲得一條1 300 bp左右的特異片段，然后通過克隆測序及軟件設計將獲得的RAPD標記轉化為更為穩定可靠的序列特異擴增區域(Sequence characterized amplified region，SCAR)標記，設計并合成一對SCAR特異引物F7/R7，能特異地從Psa中擴增出一條約950 bp的條帶，而Pss、Pto等相近菌株均未擴增出特異條帶，與傳統檢測方法以及通用引物逐步篩選法相比，該方法具有更高準確度和靈敏度。周大祥等[39-40]將疊氮溴化乙錠、疊氮溴化丙錠與實時熒光定量相結合用于Psa檢測，染料穿透死菌細胞膜從而有效區別活死菌，彌補了PCR的不足，但因染料較貴，導致檢測成本較高，極大地制約了其廣泛推廣使用。

針對Psa的遺傳多樣性，國內外學者也開展了特定類群的檢測研究。例如2014年，Gallelli等[41]為提高Psa-V的特異性分子檢測水平，建立了一種基于EvaGreen化學染料和hrpW基因的實時熒光PCR檢測法，可特異靈敏地從獼猴桃葉片、果實和樹皮組織中檢測出Psa-V。2016年，Fujikawa[27]基于第五類群特異序列設計了能有效區別Psa5和其他4個類群的特異性引物Con002F/R、Con034F/R、Con044F/和Con067F/R，PCR及電泳結果證明這4套引物對均能從Psa5擴增出單一條帶。2017年，Ruinelli等[42]采用比較基因組學方法，利用已公開的Psa基因組數據，選擇獨特的靶區，建立了兩種能夠檢測Psa的環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，PSA LAMP和PSA3 LAMP，可區分不同類群的Psa，PSA LAMP對除第四類群(低毒力菌株)的其他3個類群產生陽性結果，而PSA3 LAMP只特異性針對普遍流行的第三類群Psa3。兩種LAMP檢測方法均有強特異性，親緣關系較近的Psth、Pto、Pss等丁香假單胞桿菌其他致病變種均不能產生陽性結果；同時LAMP檢測不僅能從無癥狀獼猴桃材料檢出Psa，且相比普通PCR，無需昂貴設備，所需時間更短。2021年，王一波等[43]通過簡化檢測步驟，優化PSA3 LAMP反應體系，加入熒光染料SYBR Green I等使反應結果可視化，減少對儀器設備的依賴，有效發揮LAMP在田間廣泛應用的潛力。

4 展望

自獼猴桃細菌性潰瘍病首次報道以來，該病害已快速向世界各國擴散流行。目前，我國獼猴桃主產區基本都有該病害的發生，嚴重制約了我國獼猴桃產業的健康發展。而該病害得以快速流行和暴發的其中一個重要因素就是缺乏對病原菌快速、準確和靈敏的檢測方法，本文總結了現有的各種獼猴桃細菌性潰瘍病菌檢測方法，重點比較了各自的優缺點。展望未來，有必要在下面幾個方面予以進一步加強：

首先，需要推動現有檢測技術產品化。隨著免疫技術的發展，膠體金試紙條在植物檢疫中的利用已較成熟，目前我國已開發出多款可供基層使用的相應檢測試紙條產品，國外也有獼猴桃細菌性潰瘍病抗體制備的報道，但獼猴桃細菌性潰瘍病相關免疫學試紙條仍待開發，以滿足農戶等非專業人員和設備簡單的基層檢疫部門大規模普篩等需求。相比于普通PCR、qPCR及RT-PCR，LAMP具有設備簡單、反應時間短、結果可視化等特點[42]，克服了分子檢測需要昂貴的配套設備、專業的儀器及專業的檢測技術知識等缺點[21]，能較好滿足田間對獼猴桃細菌性潰瘍病檢測需求。

其次，各檢測方法有利有弊，應采取多種檢測方法相結合以達到更好的檢測效果。例如噬菌體不僅可以作為生物制劑有效防控獼猴桃細菌性潰瘍病，還可以用于獼猴桃細菌性潰瘍病菌的檢測。噬菌體是一種特異性感染靶細菌的病毒，由于其寄主范圍的特殊性，可用于特定植物病原細菌種類和菌系的鑒別、預測病菌的消長、檢測種子苗木的帶菌及病菌存活情況，在植物病害研究中具有重要的理論和實踐意義[6]。2007年，雷慶等[44]以丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種為指示菌，從獼猴桃細菌性潰瘍病病枝中首次分離到一株噬菌體。近幾年，雖然國內外均有報道利用分離噬菌體生物防治獼猴桃細菌性潰瘍病菌[45-49]，然而，噬菌體在獼猴桃潰瘍病菌的檢測以及區分其各類群的差異方面仍未見文獻報道，迫切需要進一步加強相關領域的研究。