獨腳金內酯(GR24)對微藻-真菌凈化水產養殖廢水效果的影響

弓忠孝

(呼和浩特市土默特左旗哈素海服務中心，內蒙古 呼和浩特 010100)

隨著生活水平的提高，我國人民對水產品的需求量正逐年增大，這也促進了我國水產養殖業的發展。據統計，2018年我國水產養殖總量超過5 000萬t，占水產品總量的78%以上[1]。為保證養殖水的質量，在水產養殖過程中需定期且頻繁地進行換水處理，其結果是造成大量含氮、磷、有機物廢水的外排。而養殖廢水未經妥善處理即排放則會引發系列環境污染問題，導致病害滋生并成為制約水產養殖業進一步發展的限速環節。

微藻作為一種光自養型生物具有環境適應性強、生長速度快、生長周期短、能有效降解有機物、固定水體氮磷等諸多優點[2]。而水產養殖廢水中所富含的營養物質(含碳有機物、氮和磷)可為微藻的生長提供廉價營養原料。如Ansari等[3]利用3種微藻開展了對尼羅羅非魚養殖廢水的處理研究，發現養殖廢水中總氮(TN)、總磷(TP)和化學需氧量(COD)去除率可分別達到76%～81%、100%和42%～69%。呂俊平等[4]研究也發現，綠球藻能夠去除水產養殖廢水中96.92%的COD、98.08%的氨氮及98.36%的TP。值得一提的是，與傳統處理方法相比，利用微藻實現對廢水的凈化處理具有效率高、能耗低、無化學添加等諸多突出優勢[5]。此外，在實現廢水生物凈化的同時，還能實現微藻自身生物量的增殖，增殖的微藻通過深加工工藝還可轉化為生物燃料、化工原材料及動物餌料等[6]。

真菌對廢水中的大多數有機污染物同樣具有較好的降解能力，因而可與微藻結合形成具有多種功能的微藻-真菌共生體系并應用于廢水處理領域。而這一目標之所以能實現是源于微藻-真菌能建立互利關系，即微藻通過光合作用有效固定真菌分解代謝過程中所產生的CO2及水中以碳酸鹽、重碳酸鹽形式存在的CO2，并將其轉化為真菌可利用的物質如氨基酸、碳水化合物、脂肪及其他營養素形式的碳源[7]；同時真菌可分泌微藻快速生長所需的維生素、吲哚-3-乙酸等生長激素[8]。現有研究結果也證實了細菌、真菌介入后所形成的藻-菌共生體系對廢水處理有積極作用。如黃靜依等[9]研究發現，選用小球藻、隱藻分別構建菌-藻共生系統，均表現出比純藻系統更高的生物量及對水產養殖廢水中氮磷更高的去除率。此外，在微藻-真菌共生體系中，真菌的存在能輔助微藻進行生物絮凝，并通過胞外多糖黏附、靜電中和及微藻與真菌菌絲表面蛋白質相互作用，成功地形成藻-菌球，從而解決單一微藻處理廢水過程中微藻無法有效分離和回收的問題[10]。

提取于植物根系分泌物的獨腳金內酯最初作為一種重要的激素類物質，可用于調控植物的生理代謝過程及促進植物的生長[11]。現有深入研究發現，獨腳金內酯的誘導還能刺激真菌線粒體代謝及促進叢枝菌根真菌的分枝、繁殖[12]。而作為一種人工合成的獨腳金內酯(GR24)，GR24被認為可參與藻類細胞的生化反應。如研究發現，當體系中添加適量的GR24后，小球藻的相關生長、光合性能參數指標均得到增強，從而增強共培養體系對廢水中營養物質的去除性能[13]。此外，在藻-菌共生體系中添加GR24能有助于體系中形成穩定且大小均一的藻-菌球[14]。

利用藻類技術處理水產養殖廢水既具有生態效益又有一定的經濟效益，但提高水產養殖廢水中污染物質的去除效率是藻類技術應用于水產養殖廢水凈化處理的關鍵。目前已有大量對藻類技術進行改進的相關研究報道，諸如涉及到藻種的選擇、光照培養條件的優化、微藻-真菌共生體系的優化等。目前，外源添加GR24，同時利用微藻或微藻-真菌共生體系處理水產養殖廢水的研究在國內還鮮見報道。為此，本研究采用兩種藻類處理技術(小球藻單養、小球藻-靈芝菌共生)凈化處理水產養殖廢水。研究過程中通過改變外源GR24的添加量，關注GR24濃度變化對兩個處理體系中微藻/藻-菌共生體生長性能、光合性能、對水產養殖廢水中營養物質的去除性能的影響，并根據廢水凈化效果優選出最佳的藻處理技術及GR24的最佳外源添加量。研究結論能為藻類技術在水產養殖廢水凈化處理領域的應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實驗涉及的儀器包括：TG-17型高速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；BKQ-B50II型全自動數顯立式壓力蒸汽滅菌器，山東博科消毒設備有限公司；HT-12X2C型搖床，上海赫田科學儀器有限公司；202-2AB型臥式電熱恒溫鼓風干燥箱，廣東佛衡儀器有限公司；YJ-VS-1型超凈工作臺，無錫一凈凈化設備有限公司；UV5型紫外分光光度計，梅特勒-托利儀器(上海)有限公司；MS204/A型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；QL-866型旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

實驗所用材料和試劑包括：葡萄糖、丙酮、無水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸、冰乙酸、氫氧化鈉、二水合磷酸二氫鈉、重鉻酸鉀、抗壞血酸、二水合氯化鈣、硫酸亞鐵銨、七水合硫酸鎂、鉬酸銨溶液、三水合磷酸氫二鉀、過硫酸鉀、尿素均購置于上海國藥集團化學試劑有限公司。實驗所使用的GR24(CAS No：76974-79-3)購于上海懋康生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 藻種和真菌

小球藻Chlorellavulgaris(FACHB-8)購自中國科學院武漢水生生物研究所；靈芝菌Ganodermalucidum(5.765)從中國普通微生物菌種保藏管理中心獲取，并根據相關文獻制備小球藻和靈芝菌培養基，小球藻和靈芝菌的培養與擴培參照相關文獻進行[15]。

將擴培的靈芝菌球懸浮液(84.29 mg·L-1)5 mL加入到100 mL小球藻懸液(76.28 mg·L-1)中，使小球藻與靈芝菌共培養體系初始濃度約為89.63 mg·L-1。利用10%的水產養殖廢水將小球藻-靈芝菌混合體系于恒溫搖床上(25±2)℃ 150 r·min-1馴化培養7 d。馴化后的小球藻-真菌顆粒將用于后續水產養殖廢水的凈化處理。

1.3 兩種藻類處理技術體系的構建

實驗所使用的GR24使用前用二甲基亞砜(純度>99%)溶解后用水稀釋配制成一定濃度的溶液，稀釋法遵循Wang等[16]的研究方法。

處理體系1中小球藻-靈芝菌共培養液為1 L，最初的藻類和靈芝菌的生物量比為1∶10，其總懸浮固體濃度為0.82 g·L-1。處理體系2為小球藻單養。

1.4 光生物反應器

光生物反應器為1個16.8 L的玻璃罐(圖1)。實驗處理前，預先向反應器(帶LED燈管)中注入2.8 L水產養殖廢水，隨后分別采用兩種不同處理體系分別對該水產養殖廢水進行處理。水產養殖廢水凈化處理光照強度為200 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h:12 h，反應溫度為(25±2)℃。

圖1 光生物反應器結構

1.5 水產養殖廢水水質特征

實驗所用水產養殖廢水取自內蒙古呼和浩特市某水產養殖企業，并于4 ℃條件下儲存備用。凈化處理前為避免原有水產養殖廢水中微生物的影響，預先使用0.45 μm尼龍微濾器過濾并進行滅菌處理，經處理后其COD含量為49.61 mg·L-1、TN含量為26.58 mg·L-1、TP含量為2.75 mg·L-1、pH 7.5±0.1。

1.6 處理設計

利用光生物反應器，采用兩種不同的藻類體系分別對水產養殖廢水開展凈化處理。處理時，光生物反應器中兩個處理體系中初始生物量均為89.63 mg·L-1。在水產養殖廢水凈化處理前向各處理體系中添加GR24，共設置4個濃度水平(0、10-7、10-9和10-11mol·L-1)。光照反應器運行處理10 d，實驗期間在水產養殖廢水凈化處理的第3、7和10 天分別從反應器采樣口采集樣品并開展相關指標的分析檢測，以評判兩種藻類技術對水產養殖廢水凈化處理的效果，從而最終確定最佳藻類處理技術和GR24添加量。

1.7 分析方法及數據處理

參照文獻[17]分析方法，在處理的第3、7和10天分別測定兩種藻類處理技術體系中小球藻葉綠素a(CHL-a)含量。水產養殖廢水凈化處理的第10天，從光生物反應器吸取50 mL處理液，參照Zhang[18]的方法測定生物質的比生長率和平均日產率。實驗處理的第10天，從光生物反應器取樣口取2 mL不同處理體系的混合液，置黑暗處適應25 min后利用Aquapen手持式葉綠素熒光測量儀測定葉綠素熒光變化(OJIP open-JIP test)，并通過OJIP測定獲得相關熒光參數指標，用以評價不同處理體系中小球藻的光合活性。實驗處理的第3、7和10 天從光生物反應器對不同體系處理后的水產養殖廢水進行取樣。參照相關分析方法，對采集廢水樣品進行預處理及COD、TN和TP的分析測定[19]。

每組實驗處理均設3個重復，所有實驗數據結果均為數據平均值，數據統計分析采用SPSS 19.0軟件。采用Duncan’s多重比較法檢驗不同處理體系中GR24濃度變化對藻菌生長、光合參數和對水產養殖廢水凈化效果影響的顯著差異性。

2 結果與分析

2.1 GR24濃度對生物量的影響

利用微藻或微藻-靈芝菌共生技術處理水產養殖廢水，其處理效果在很大程度上受限于體系中微藻或微藻-靈芝菌共生體的比生長率，比生長率高代表著體系中微藻或微藻-靈芝菌共生體的繁殖速率越快，也就意味著對水產養殖廢水的凈化效果越好。在GR24設置的4個濃度水平(0、10-7、10-9和10-11mol·L-1)條件下，利用不同藻類處理體系對水產養殖廢水進行凈化處理，不同處理體系中微藻或微藻-靈芝菌共生體的比生長速率和平均日產率結果見表1。

表1 GR24濃度對凈化水產養殖廢水的影響

由表1數據可以看出，兩個處理體系中的小球藻均能正常存活。統計結果表明，GR24添加量的變化對兩個處理體系中的小球藻的生長均會產生顯著的影響。與空白對照組(不添加GR24)相比，處理體系中添加GR24(≥10-9mol·L-1)均顯著促進了小球藻的生長。隨著GR24濃度的增加，兩個處理體系中小球藻的比生長率和平均日產率均呈現先增大后降低的變化趨勢，當GR24在體系中的初始濃度為10-9mol·L-1時生長效果最佳，此時，小球藻的比生長率分別為0.398(處理體系1)和0.341 d-1(處理體系2)；小球藻的平均日產率為0.189(處理體系1)和0.156 g·L-1·d-1(處理體系2)。

2.2 GR24濃度對微藻光合性能的影響

光合作用是藻類重要的生理活動過程，而CHL-a則在光合過程中發揮重要作用，因此，CHL-a是評價微藻生長的重要間接指標。GR24濃度變化對兩種藻類技術處理體系中小球藻CHL-a濃度變化的影響結果如圖2所示。在水產養殖廢水凈化處理的第3、7和10 天，處理體系1中的小球藻CHL-a含量相對高于處理體系2。在不同GR24濃度條件下，兩個處理體系中小球藻CHL-a含量均在處理的第7 天達到最大值。處理第7 天，在處理體系1和處理體系2中，當GR24的濃度為10-9mol·L-1時小球藻CHL-a的含量最高，分別為226.84和189.69 μg·L-1。

同組柱上無相同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，圖3同。

葉綠素a熒光瞬變技術(OJIP)是研究植物光合作用或外界脅迫作用時常采用的方法。當生長環境出現變化時微藻的光合活性等參數也會隨之發生響應變化，這時也可以用OJIP技術進行測試和表征。通過OJIP曲線可獲得相關光合參數如Fv/Fm、PIABS、ΨO、ΦEO等，其中Fv代表最大可變熒光；Fm代表OJIP峰值P處記錄的最大熒光強度；Fv/Fm代表了PSⅡ最大量子效率，該參數反映了PSⅡ反應中心內光能轉換效率；PIABS表征PSⅡ吸收光子的性能指數；ΨO代表了推動QA還原激子的比率；ΦEO代表了和用于電子傳遞的量子產量[20]。

不同GR24濃度條件下，利用兩種藻類處理技術對水產養殖廢水處理10 d后對小球藻的OJIP曲線進行了測試(表2)。從表2數據可以看出，隨著GR24濃度的增加，兩個處理體系中Fv/Fm、PIABS呈現先升高后降低的變化趨勢。當體系中GR24濃度為10-9mol·L-1時，各處理體系中Fv/Fm、PIABS值均顯著高于其他GR24濃度添加水平。這說明處理體系中添加適量的GR24(10-9mol·L-1)對處理體系中微藻PSⅡ的光促反應有一定的促進作用。ΨO、ΦEO可用于評判GR24濃度變化對藻類-真菌共生體的影響。從表2數據可以看出ΨO、ΦEO隨GR24濃度的變化趨勢與Fv/Fm和PIABS值的變化一致。說明處理體系中適量添加GR24可以促進微藻對光的吸收而提高電子轉移效率和強化最大電子轉移產率。

表2 處理第10 天凈化水產養殖廢水的光合性能參數變化

2.3 GR24濃度對水產養殖廢水中營養物質去除效果的影響

整個實驗階段在不同GR24濃度下，兩種藻類處理技術對水產養殖廢水的凈化效果見表3。處理體系1凈化處理水產養殖廢水第3、7和10 天，廢水中COD、TN和TP去除效率隨GR24濃度變化的結果見圖3。

從表3數據可以看出，當處理體系中GR24濃度發生變化時，不同處理體系對COD的去除效率存在差異。與空白對照組(不添加GR24)相比，當GR24的濃度為10-9～10-7mol·L-1時GR24對該水產養殖廢水COD的去除具有促進作用，這說明適量添加GR24能誘導小球藻同化更多廢水中的含碳營養物質，這一結果與小球藻的生長速率和平均日生產率變化規律相一致(表1)。當GR24的濃度為10-9mol·L-1時COD的平均去除效果最佳，分別為92.5%(處理體系1)和87.9%(處理體系2)。從圖3可以看出，從第3 天到第7天在處理體系1(小球藻-靈芝菌)中COD的去除率增大，然后從第7 天到第10 天COD的去除率下降。在處理的第7 天，當GR24濃度為10-9～10-7mol·L-1時COD去除效果最佳(93.7%～96.3%)。

表3 不同GR24濃度下水產養殖廢水中COD、TN和TP去除效率

圖3 不同GR24濃度下處理體系1COD、TN和TP的去除率

與空白對照組(不添加GR24)相比，當GR24的濃度為10-9～10-7mol·L-1時GR24對沼液TN的去除存在明顯促進作用(表3)。當GR24的濃度為10-9mol·L-1時TN的平均去除效果最佳，分別為94.9%(處理體系1)和90.6%(處理體系2)。在處理體系1中TN去除率隨時間的變化趨勢與COD去除率的變化趨勢相一致。在處理的第7 天，當GR24濃度為10-9mol·L-1時TN去除效果最佳(98.3%)。

TP的去除是衡量藻類技術營養鹽去除效率的重要指標之一。從表3可以看出，當GR24的濃度為10-9mol·L-1時TP的平均去除效果最佳，分別為97.1%(處理體系1)和92.8%(處理體系2)，依然表現為處理體系1>處理體系2。在處理體系1中TP去除率隨時間的變化仍表現為先升高后降低的變化趨勢，類似于COD和TN去除率的變化。在處理的第7 天，當GR24濃度為10-9～10-7mol·L-1時TP去除效果最佳(96.5%～98.1%)。

以上分析結果表明，在不同GR24濃度下，借助不同的處理體系，水產養殖廢水中各營養物質的去除效率存在差異。其中，利用小球藻-靈芝菌的共生體系(處理體系1)，在GR24濃度為10-9mol·L-1時廢水中各營養物質的去除效率表現最佳，說明GR24的外源添加量具有最適值。

3 小結與討論

Song等[21]研究認為，獨腳金內酯的存在對微藻的生長不會產生明顯的促進作用，這與本研究結論不一致。這可能是因為實驗中用到的獨腳金內酯成分、選擇的藻種、藻菌共生體系、光照處理條件、處理對象存在差異。Zhang等[13]的研究也發現，當外源添加GR24濃度為10-9mol·L-1時，藻-菌共生體系中微藻的生長狀態處于較好水平。這與本實驗的研究結論相一致。相關研究認為，這主要是源于體系中存在適量的GR24(10-9～10-7mol·L-1)能通過調控相關基因來促進微藻細胞的生長[22]。兩種藻類處理技術相較而言，小球藻的比生長率和平均日產率均表現為處理體系1>處理體系2。

在兩種藻類技術處理體系中，外源添加GR24的最佳濃度為10-9mol·L-1。這與前人的研究結果相一致[23]。這說明適量添加GR24對體系中小球藻的生長有促進作用，從而促進CHL-a含量的增加。這可能是因為外源添加的GR24能促進共生體系中微藻葉綠素合成基因表達的增強[13]。此外，有研究發現培養體系中添加GR24能促進真菌菌絲的生長，從而能進一步增加藻類生物間的接觸頻率，促進微藻-真菌球的形成[24]。OJIP的分析結果與CHL-a的含量變化結果(圖2)相一致，這也間接說明了CHL-a在光合作用過程中所發揮的重要作用[25]。相較而言，在不同GR24濃度添加水平條件下，不同處理體系中小球藻相關光合參數值的高低順序均表現為處理體系1>處理體系2。

微藻細胞中的基本元素碳約占其生物總量的50%，而碳同化作用是利用微藻技術去除水體中碳的主要機制[26]。除了對水體中碳源的利用，微藻在光合作用過程中還能將廢水中的氮和磷等營養物質合成復雜的有機物，實現對水體氮、磷的去除。其中氮的去除主要是源于微藻在繁殖過程中需要利用氮來合成大量的核酸和蛋白質類組分[27]。陳海敏等[28]利用小球藻單養和小球藻+光合細菌聯合技術處理甲魚養殖廢水時也發現,藻菌聯用技術對廢水中TN的去除效果要優于微藻單養技術。此外，處理體系中添加適量的GR24(10-9mol·L-1)有利于體系中藻-菌共生體的增殖，因而除氮效果好；而添加量過多(10-7mol·L-1)、過少(10-11mol·L-1)或不添加(0 mol·L-1)均存在不利影響，因而導致除氮效果表現相對較差。磷既是微藻細胞膜組分磷脂的構成元素，也是為藻細胞功能發揮提供能量物質三磷酸腺苷的必要組分，因而同樣可以在微藻的增殖過程中從廢水中去除[29]。另一方面，靈芝菌(真菌)分泌的胞外多糖有助于微藻細胞被真菌顆粒捕獲或附著在真菌菌絲上，使得真菌可以為微藻的生長提供更大的接受面，從而提高營養物質的去除效率[30]。

本研究在改變GR24濃度添加水平條件下，研究了小球藻-靈芝菌、小球藻單養兩種藻類技術對水產養殖廢水的生物凈化效果。實驗結果表明，外源添加GR24的最佳濃度水平為10-9mol·L-1；兩種藻類技術處理體系相比較而言，小球藻-靈芝菌共培養系統顯著提高了光合速率、生物量、廢水中營養物質去除效果。在最佳條件下(GR24濃度為10-9mol·L-1)，水產養殖廢水中COD、TN和TP的平均去除率分別為92.5%、94.9%和97.1%。本研究為微藻生物水產養殖廢水提供了切實可行的微藻-真菌共培養策略。