基于番鴨細小病毒VP3蛋白的間接ELISA方法建立

葉偉成， 云濤， 朱寅初， 倪征， 陳柳， 華炯鋼， 張存

(浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021)

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起，是一種以喘氣、腹瀉、軟腳、胰壞死和出血及纖維素性腸炎為主要特征的急性敗血性傳染病，因其主要侵害3周齡內雛番鴨，故又稱“三周病”[1-3]。番鴨細小病毒病傳染性極強，發病率和死亡率高，3周齡以內的雛番鴨，發病率為27%～62%，病死率為40%～65%；患病鴨痊愈后往往成為僵鴨[4-5]，給番鴨養殖業造成嚴重的經濟損失。

MDPV屬細小病毒科、細小病毒屬，為單鏈線性DNA病毒。病毒粒子直徑20～22 nm，為圓形或六角形，無囊膜，呈二十面體對稱。基因組長5 136 bp，由左右兩個開放閱讀框(open reading frame，ORF)和兩端的末端重復序列(inverted terminal repeats，ITR)組成[6-7]。在兩個ORF之間間隔18 bp，左側ORF編碼NS1和NS2兩個非結構蛋白，右側ORF編碼結構蛋白，結構蛋白VP1、VP2和VP3基因的起始密碼子位置不同，但共用同一終止密碼子，即VP1基因含有組成VP2和VP3的全部基因編碼序列，其中VP2結構蛋白具有免疫原性，是病毒刺激機體產生保護性抗體的重要蛋白抗原；VP3是主要衣殼蛋白，約占總蛋白的80%[8-9]，也是蛋白抗原核心結構域。

本研究對番鴨細小病毒VP3基因進行了克隆、原核表達，并將表達產物VP3蛋白過鎳柱純化，以純化VP3蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA檢測番鴨細小病毒抗體的方法，該方法的建立為該病疫苗免疫抗體的檢測和流行病學調查提供了技術手段。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體、菌種及血清

番鴨細小病毒由本實驗室分離并保存，番鴨細小病毒標準陰、陽性血清、兔抗番鴨IgG-HRP二抗由本實驗室自制。原核表達載體pET-28a(+)為本實驗室保存，感受態細胞Trans T1、BL21(DE3)購自北京全氏金生物技術有限公司。鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、禽流感病毒(AIV NH9)、呼腸孤病毒(DRV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、MDPV等的番鴨陽性血清均由本實驗室制備保存。

1.2 主要試劑與溶液

DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、T載體連接試劑盒、高保真酶、限制性內切酶均購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)；質粒小量抽提試劑盒購自Omega公司；ClonExpress購自Vazyme公司；正辛酸、尿素、protein marker、30%聚丙烯酰胺、SDS、考馬斯亮藍R-250、卡那霉素、IPTG等試劑和培養基購自上海生物工程有限公司；Ni-NTA蛋白親和層析柱購自Novagen公司。包被液(0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)、洗滌液(PBST，pH 7.4)、封閉液(10%脫脂奶粉的PBST)、血清稀釋液(10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST)、底物緩沖液(0.025 mol·L-1檸檬酸，0.05 mol·L-1磷酸氫二鈉，1.11 g·L-1過氧化氫)、底物(取10 mg TMB溶解到1 mL的DMSO中)、終止液(2 mol·L-1硫酸溶液)等自配。

1.3 MDPV VP3基因擴增

根據GenBank發表的番鴨細小病毒的序列設計了含有NcoI、XhoI酶切位點并帶有插入PET-28a位點同源序列的一對引物(粗體部分為同源序列)，上游MDPV-VP3-y：5′-agaaggagatataccatggcaga gggaggaagcggag-3′，下游MDPV-VP3-y2：5′-ggtggtgg tggtgctcgagcagattctgagtcaaatac-3′，以抽提的番鴨細小病毒DNA為模板PCR擴增出番鴨細小病毒的VP3基因，反應體系如下：2×buffer 25 μL，2 mmol·L-1dNTPs 10 μL，上下游引物各2 μL，模板2 μL，加水至50 μL。反應程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 2 min，30個循環；68 ℃延伸10 min，PCR產物VP3基因經檢測后回收，置于-20 ℃保存備用。

1.4 PET-28a-VP3質粒的構建、表達及純化

將PET-28a用NcoI、XhoI雙酶切過柱回收與VP3基因PCR產物進行重組反應，重組反應體系為：2×ClonExpress Mix 5 μL，PET-28a 1 μL，VP3基因PCR產物1 μL，ddH2O 3 μL。重組反應：50 ℃，15 min；降至4 ℃或立即置于冰上冷卻，轉化于Trans-T1感受態菌，卡那霉素抗性篩選及PCR鑒定的陽性克隆菌經測序驗證正確后，抽提質粒轉化入BL21表達菌，經IPTG誘導表達出含His標簽的VP3蛋白，并經鎳柱過柱純化獲得純度較高的番鴨細小病毒VP3蛋白。

1.5 兔抗番鴨IgG的制備

無菌采取3月齡番鴨的血30 mL，分離血清，取番鴨血清10 mL用辛酸-硫酸銨法提取番鴨IgG[10-11]，提取的番鴨IgG經透析后用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBS配制1 mg·mL-1的濃度，加等量弗氏完全佐劑，用全自動樣品快速研磨儀研磨5 min制成均勻乳劑，背部皮下多點免疫1.5 kg左右的新西蘭大白兔2只，每只注射2 mL，首免后第14天和第28天用弗氏不完全佐劑乳化的番鴨IgG加強免疫二次，免疫劑量和途徑同首免，三次免疫后14 d心臟采血分離血清，送華安生物技術有限公司進行兔抗番鴨IgG純化及HRP的標記。

1.6 間接ELISA檢測方法的建立

1.6.1 抗原包被濃度與待檢血清最佳稀釋度的確定

純化后的蛋白用包被液稀釋成20.000、10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 μg·mL-1，每個稀釋度16孔重復，每孔加100 μL，4 ℃包被過夜；洗板3次，拍干后每孔加封閉液400 μL，37 ℃封閉1 h，洗板3次，拍干。加經稀釋的血清，每孔100 μL，陽性血清和陰性血清分別用稀釋液按1∶25、1∶50、1∶100、1∶200等4個稀釋度稀釋，37 ℃孵育1 h；洗板3次，拍干，加1∶2 500倍稀釋酶標二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板3次，拍干后加經底物緩沖液作100倍稀釋的底物100 μL，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μL測定血清D450值[12]。

1.6.2 最佳樣品稀釋液的確定

在最佳抗原濃度包被、封閉液為10%脫脂奶粉的PBST的條件下，用不同的稀釋液將陰陽性血清做100倍稀釋進行間接ELISA試驗，測定陰、陽性血清D450值，并根據P/N值確定最佳樣品稀釋液。

1.6.3 最佳封閉液的確定

在最佳抗原濃度包被的條件下，分別用5%、10%、15%的明膠，5%、10%、15%的BSA，5%、10%、15%的小牛血清，10%的脫脂奶粉進行封閉。并用不同的樣品稀釋液及選取的最佳稀釋液，將陰、陽性血清作1∶100稀釋，按照間接ELISA的操作方法進行試驗，確定最佳封閉液。

1.6.4 酶標二抗作用濃度的確定

抗原包被濃度、封閉液、血清稀釋液、陰陽血清稀釋濃度都按試驗結果確定的最佳條件，酶標二抗體作1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶3 500、1∶4 000、1∶4 500等7個稀釋度，每個稀釋度加6孔，即陰陽血清各3個重復，進行ELISA試驗，測定其D450值。通過對D450值的分析以及間接ELISA的判定標準，選出二抗的最佳稀釋度。

1.6.5 間接ELISA方法檢測臨界值的確定

按已確定的最佳條件的ELISA檢測方法對實驗室保存的15份MDPV陰性血清進行檢測，計算出D450值的平均值和標準差，確定陽性樣品的臨界值，當待檢樣品D450值大于臨界值時判定為陽性[12-13]。

1.6.6 特異性試驗

采用本試驗建立的間接ELISA方法對番鴨MDPV、鴨肝炎病毒(DHV)、鴨呼腸孤病毒(DRV)、禽流感病毒(AIV)、鴨瘟病毒(DPV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)等的陽性血清及MDPV陰性血清進行檢測，根據檢測結果判定間接ELISA方法的特異性。

1.6.7 敏感性試驗

將1份MDPV陽性血清作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200稀釋，1份MDPV陰性血清作1∶100稀釋，按建立的間接ELISA方法進行ELISA試驗，測定其D450值。

1.6.8 重復性試驗

批內重復試驗。取MDPV陽性血清4份及1份陰性血清，每份樣品分成3份，置-20 ℃冰箱保存備用。在不同時間取其中的一份樣品，用本試驗建立的間接ELISA檢測方法，在同一次包被的酶標板上，重復檢測3次，測定其D450值，進行統計分析。

批間重復試驗。取MDPV陽性血清4份及1份陰性血清，每份樣品分成3份，置-20 ℃冰箱保存備用。在不同時間取其中的一份樣品，用本試驗建立的間接ELISA檢測方法，在不同批次包被的酶標板上，重復檢測3次，測定其D450值，對結果進行統計分析。計算出每份血清樣品的平均值和標準差，根據統計學變異系數公式得出每份血清的變異系數[13-15]。

1.6.9 符合率試驗

100份番鴨血清分別以本研究建立的間接ELISA方法和血清學中和試驗進行檢測。中和試驗在96孔板培養的細胞上進行，MDPV細胞適應毒稀釋到每單位劑量200 TCID50，與等量倍數遞進稀釋的血清混合，37 ℃孵育1 h后，接種長成單層DEF細胞的96孔板，每個血清稀釋度設5個重復，繼續培養72 h后觀察細胞病變。根據本實驗室中和試驗方法結果，中和抗體滴度大于或等于1∶16判為陽性，小于1∶16判為陰性。統計計算兩種方法的符合率[12-15]。

2 結果與分析

2.1 MDPV VP3基因的原核表達

2.1.1 PCR擴增VP3基因

以MDPV基因組DNA為模板，用引物MDPV-VP3-y、MDPV-VP3-y2擴增出與預期結果符合，大小1 650 bp左右的特異性條帶(圖1)。

圖1 PCR產物電泳圖譜

2.1.2 PET-28a-VP3質粒的構建、表達及純化

構建好的PET-28a-VP3質粒，經測序驗證后轉化BL21表達菌，經IPTG誘導表達4 h，離心棄上清，菌體用包涵體洗脫液重懸(20 mmol·L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1EDTA、1% Triton-X100)，然后加1%溶菌酶，37 ℃作用15 min后在冰上用超聲波裂解40 min，離心棄上清(留樣1～2電泳)，沉淀用包涵體洗脫液、不含1% Triton-X100的包涵體洗脫液先后各洗2次，洗后的沉淀用8 mol·L-1的尿素溶解獲得含His標簽的VP3蛋白(圖2)，并經鎳柱純化獲得純度較高的番鴨細小病毒VP3蛋白。

M—蛋白Marker；1～2—洗前上清；3～5—洗3次的上清；6～7—尿素溶解后上清；8～9—尿素溶解后沉淀。

2.2 HRP標記的兔抗番鴨IgG的制備

3月齡番鴨的血清經辛酸-硫酸銨法提取，獲得較純的番鴨IgG(圖3)，經透析后的番鴨IgG用弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑多點皮下免疫兔子3次后，經瓊擴試驗結果表明，兔抗番鴨IgG的效價為1∶8，心臟采血分離血清，送華安生物技術有限公司進行兔抗番鴨IgG純化及HRP的標記，獲得HRP標記的兔抗番鴨IgG的抗體1 mL。

M—蛋白Marker；1～3—提取的番鴨IgG。

2.3 間接ELISA檢測方法的建立

2.3.1 最佳抗原包被濃度與待檢血清最佳稀釋度的確定

間接ELISA測得的D450值見表1，VP3蛋白以5.000 μg·mL-1濃度包被，血清以1∶100稀釋時，陽性血清D450值(P)為1.025，陰性血清D450值(N)為0.088，P/N為11.648，比其他蛋白包被量和血清稀釋度組合都高。因此，確定最佳抗原包被濃度為5.000 μg·mL-1，血清稀釋度為1∶100。

表1 抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋濃度的確定

2.3.2 待檢血清最佳稀釋液的確定

從表2中可見，封閉液為10%脫脂奶粉的PBST時，血清樣品稀釋液為10%脫脂奶粉的PBST或含10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST時效果都比較好，但后者效果略好于前者，因此，我們選用含10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST作為樣品的稀釋液。

表2 不同樣品稀釋液對ELISA檢測結果的影響

2.3.3 最佳封閉液確定

從表3可見，在這幾種封閉液封閉的情況下，10%脫脂奶粉的PBST或含10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST效果優于其他稀釋液，稀釋樣品血清時，非特異性反應都較低。使用這兩種樣品稀釋液時，封閉液用含5%～10% BSA或5%明膠或5%～10% FBS或10%脫脂奶粉的PBST無明顯差異。本實驗后續考慮使用方便、價格等選用含10%脫脂奶粉的PBST作封閉液。

表3 不同封閉液、樣品稀釋液對ELISA結果的影響

2.3.4 酶標二抗最佳稀釋度的確定

在其他條件不變的情況下，酶標二抗體作1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶3 500、1∶4 000、1∶4 500等7個稀釋度各加6孔，即陰陽血清各3個重復，進行ELISA試驗，測定其D450值，計算出陰陽性血清的平均值及P/N(表4)。從表中可見酶標二抗體作1∶2 500稀釋時，P/N最高為8.660，所以二抗的最佳稀釋度為1∶2 500。

表4 酶標二抗最佳稀釋度的確定

2.3.5 臨界值確定

根據實驗室保存的15份陰性血清測定的D450值，計算出其平均值為0.142 7，標準差為0.019 4。根據統計學原理，本ELISA試驗的臨界值(陽性判定值)為0.201。

2.3.6 特異性試驗

用本試驗建立的間接ELISA檢測抗體的方法對MDPV、AIV、DTMUV、DHV、DPV、DRV等陽性血清及MDPV陰性血清進行檢測，測定D450值，結果除MDPV陽性血清為陽性外，其余病毒血清及MDPV陰性血清D450值都在0.167 2以下，均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。

2.3.7 敏感性試驗

MDPV陽性血清作100倍稀釋后，稀釋至3 200倍，每稀釋度重復加2孔，并設有MDPV陰性血清對照(2孔)進行間接ELISA檢測抗體的試驗，測定的D450值見表5。從測定結果可見，陽性血清稀釋至1 600倍時，D450值是0.318，大于0.201為陽性，說明本試驗建立的間接ELISA檢測抗體的方法有較高的敏感性。

表5 敏感性試驗結果

2.3.8 重復性試驗

按建立的間接ELISA檢測抗體的方法對5個血清樣品進行批內、批間重復性試驗，根據測定的D450值計算出平均值、標準差及變異系數(表6)。批內重復試驗的變異系數在4.2%～8.3%，批間重復性試驗的變異系數為2.3%～8.7%，均小于 10%，說明該間接ELISA方法重復性好。

表6 重復性試驗結果

2.3.9 符合率試驗

由表7可見，兩種方法檢測的結果存在一定的差異，這主要是兩種方法的敏感性不同，間接ELISA比血清中和試驗敏感所致。然而兩種方法的符合率還是比較高的，陽性符合率為91.7%(66/72)，陰性符合率87.9%(29/33)，總符合率90.5%(95/105)。說明本試驗建立的間接ELISA檢測番鴨細小病毒抗體的方法是可行的，完全可用于臨床疫苗免疫效果的監測，流行病學的調查等。

表7 間接ELISA與中和試驗檢測結果的比較

3 討論

本試驗采用原核表達帶有His標簽的番鴨細小病毒VP3蛋白作為包被抗原，原核表達抗原的表達量高，帶有His標簽，提取純化都比較簡單方便，并經試驗證明，表達的VP3蛋白不與常見的水禽病毒陽性血清發生交叉反應，特異性強，適合作為間接ELISA檢測抗體的包被抗原。經抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋度的試驗分析，確定抗原最佳包被濃度為5 μg·mL-1，血清的最佳稀釋比例為1∶100，在此條件下，P/N值最大，試驗的特異性較高。

在間接ELISA檢測抗體的試驗中，二抗也非常重要，鴨與番鴨的IgG盡管在血清學上有交叉反應，但兩者還是有較大的區別，如用鴨的二抗來替代番鴨二抗就會降低ELISA試驗的敏感性，從而會使一些陽性樣品出現假陰性，而市面上沒有番鴨的二抗可購買。為此，本試驗采用辛酸-硫酸銨沉淀法提取純化番鴨IgG。該方法操作簡便，提取的純度、含量都較高。提取的番鴨IgG經透析后用弗氏佐劑制成乳劑免疫新西蘭大白兔，制備了兔抗番鴨IgG的酶標二抗，試驗表明，制備的兔抗番鴨IgG酶標二抗，特異性強，敏感性高，在間接ELISA試驗中的最佳濃度為1∶2 500。

在ELISA試驗中為了降低非特異性反應，需要封閉液對包被好的板進行封閉，目的是封閉液中的蛋白可非特異性地將板中沒有結合包被物的位點封閉掉，這樣之后加入的抗原或抗體就不會再和板發生非特異性的結合，常用的封閉液有BSA、牛血清、脫脂乳、明膠等，明膠作為封閉液時由于不容易洗干凈未結合的明膠，封閉效果不好，本試驗也驗證了這一點。而其他三者成分與牛的血清或牛奶有關，目前在家禽上使用的疫苗都含有這些成分，如活疫苗的保護劑是5%蔗糖的脫脂乳，病毒培養的營養液含4%的小牛血清，因此在多次免疫后，動物的血清中難免有牛血清及脫脂乳的抗體，從而增加了ELISA檢測結果的背景。為了消除這個原因帶來的影響，本試驗進行了不同樣品稀釋液對間接ELISA結果影響的試驗，結果發現，10%脫脂奶粉的PBST或同時含有10%脫脂奶粉及10%小牛血清的PBST作為樣品稀釋液，就大大降低了陰性血清的D450值，P/N上升，從而增強了該方法的特異性及敏感性。

本試驗通過一系列試驗，建立了間接ELISA檢測番鴨細小病毒抗體的方法，該方法特異性強、敏感性高、重復性好、與中和試驗總符合率達90%以上，為鴨群免疫番鴨細小病毒后抗體的監測，番鴨細小流行病學的調查提供了一種操作簡便、快速的檢測方法。同時試驗過程中發現用10%脫脂奶粉的PBST或同時含有10%脫脂奶粉及10%小牛血清的PBST作為樣品稀釋液，可中和掉樣品血清中含有小牛血清、脫脂乳的抗體而大大降低了BSA、牛血清、脫脂乳作為封閉液的本底，從而提高了間接ELISA方法特異性及敏感性。這也為建立其他家禽間接ELISA檢測抗體的方法提供理論基礎及參考。