基于微衛(wèi)星復(fù)合擴(kuò)增的馬來穿山甲個(gè)體識(shí)別研究

李嘉昊 王 辰 雷 行 逯金瑤 李 立* 李 波，3*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.湖南省生物多樣性保護(hù)中心，長(zhǎng)沙，410209；3.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040)

據(jù)CITES的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2014—2018年繳獲的穿山甲非法貿(mào)易個(gè)體數(shù)量超過14萬只；另?yè)?jù)UNODC的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2015年穿山甲肉類緝獲量占比為15%，2016—2018年占比為1%～2%，但鱗片占比超過95%[3]。1998—2019年，馬來穿山甲和菲律賓穿山甲的數(shù)量急劇下降，馬來穿山甲的種群數(shù)量減少了約80%。穿山甲及其制品非法走私案件頻發(fā)使穿山甲個(gè)體識(shí)別的法醫(yī)學(xué)技術(shù)變得尤為重要。

目前，穿山甲個(gè)體識(shí)別由微衛(wèi)星技術(shù)實(shí)現(xiàn)[4-5]。最早的微衛(wèi)星位點(diǎn)是2007年基于馬來穿山甲開發(fā)的34個(gè)雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)[6]，這為亞洲穿山甲個(gè)體識(shí)別提供了研究基礎(chǔ)。高賽飛[4]從中選出6個(gè)多態(tài)性較高的位點(diǎn)，對(duì)50份穿山甲鱗片進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，認(rèn)定其來自45只個(gè)體，但由于樣本質(zhì)量不高和未進(jìn)行物種鑒定影響了個(gè)體識(shí)別的準(zhǔn)確率。Sun等[7]從中篩選出10個(gè)高多態(tài)性位點(diǎn)，成功對(duì)54只中華穿山甲進(jìn)行了基因分型，組合7個(gè)位點(diǎn)即可實(shí)現(xiàn)無關(guān)個(gè)體基因型匹配概率(probability of identity，P(ID))小于0.001，同胞個(gè)體基因型匹配概率(probability of identity for siblings，P(ID)sib)小于0.01[8]。Singh等[5]利用其中8個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建中華穿山甲和印度穿山甲個(gè)體識(shí)別體系(pangolin indexing system，PIS)，使用細(xì)胞色素b(Cytb)基因確認(rèn)待測(cè)樣本的來源物種，排除了引物對(duì)物種適應(yīng)度的影響。

目前亞洲穿山甲個(gè)體識(shí)別使用的是雙核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，擴(kuò)增過程中TaqDNA聚合酶的滑動(dòng)容易導(dǎo)致雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)出現(xiàn)影子峰而干擾基因分型，但使用較長(zhǎng)重復(fù)單位的位點(diǎn)可減少影子峰[9]。同時(shí)，微衛(wèi)星復(fù)合擴(kuò)增能夠提升鑒定效率，節(jié)約鑒定成本。根據(jù)國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)(International Society for Forensic Genetics，ISFG)對(duì)非人類個(gè)體識(shí)別的建議[10]，需要優(yōu)先使用四核苷酸重復(fù)、復(fù)合擴(kuò)增方法和新引物標(biāo)準(zhǔn)化來重構(gòu)馬來穿山甲個(gè)體識(shí)別體系。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與DNA提取

收集中華穿山甲、馬來穿山甲、印度穿山甲、樹穿山甲、大穿山甲的肌肉、鱗片和皮膚樣本總計(jì)156份，以及非穿山甲對(duì)照樣本21份(表1)，將樣本置于冰箱內(nèi)-20 ℃保存。樣本預(yù)處理后利用蛋白酶K消化，后用基因組提取試劑盒(上海百賽生物工程技術(shù)股份有限公司)提取和純化總DNA。使用紫外分光光度計(jì)(NanoPhotometer-N50，德國(guó)Implen)檢測(cè)DNA濃度。

表1 試驗(yàn)樣本信息

1.2 位點(diǎn)篩選和PCR擴(kuò)增

使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)包括6個(gè)雙核苷酸重復(fù)馬來穿山甲位點(diǎn)[6]；從長(zhǎng)尾穿山甲和南非穿山甲中篩選的4個(gè)三、四核苷酸重復(fù)位點(diǎn)[11-12]，其重復(fù)單元經(jīng)測(cè)序已確認(rèn)；以及利用SSRHunter軟件從馬來穿山甲基因組(GCF_014570535.1)[13]中篩選的四核苷酸重復(fù)位點(diǎn)(MJL04、MJL05)，這2個(gè)位點(diǎn)經(jīng)Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)成新引物后加入復(fù)合體系中(表2)。

PCR反應(yīng)采用20.0 μL體系：2×EasyTaqSuperMix(TransGen，北京)10.0 μL，正、反向引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌去離子水7.6 μL。正向引物分別用FAM、HEX和TAMRA熒光染料標(biāo)記。擴(kuò)增采用PE9700型DNA擴(kuò)增儀(PE，美國(guó))。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(90V，25 min)，并以此檢查所有引物的特異性。

1.3 復(fù)合擴(kuò)增體系優(yōu)化和評(píng)估

為優(yōu)化復(fù)合擴(kuò)增體系，使用梯度PCR測(cè)試最適退火溫度(60～72 ℃設(shè)置15個(gè)梯度)。PCR擴(kuò)增選擇3個(gè)反應(yīng)體積(40、30、20 μL)測(cè)試最適體系。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型，根據(jù)毛細(xì)管電泳的信號(hào)峰強(qiáng)度調(diào)整和確定引物的最終濃度。

選用3份樣本在3種不同的PCR儀器上用相同方案重復(fù)3次來測(cè)試復(fù)合體系的再現(xiàn)性。盲測(cè)試驗(yàn)時(shí)選用30份樣本，當(dāng)所選位點(diǎn)的P(ID)足夠小(0.000 1～0.001 0)時(shí)，對(duì)比各自基因型，具有相同基因型的樣本認(rèn)定為同一個(gè)體。

利用DNA質(zhì)量濃度梯度檢測(cè)該體系的靈敏性和有效性。DNA質(zhì)量濃度梯度分為20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 ng/μL。在上述PCR條件下，將DNA稀釋液添加到20.0 μL反應(yīng)體系中復(fù)合擴(kuò)增。利用7種非穿山甲物種(表1)評(píng)估該復(fù)合擴(kuò)增體系的物種特異性。影子峰是雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)基因分型分析中常見的現(xiàn)象，分析影子峰峰強(qiáng)度與目的產(chǎn)物峰強(qiáng)度的比例，可更準(zhǔn)確地進(jìn)行基因分型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GeneMarker 3.5進(jìn)行基因分型，Cervus計(jì)算等位基因頻率、等位基因數(shù)(number of allele，Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)[14]。多態(tài)性信息含量(polymorphism information content，PIC)和哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，H-W)用Genepop 4.2計(jì)算[15]。基因流使用Popgene 3.2計(jì)算。用STRUCTURE分析馬來穿山甲種群的遺傳結(jié)構(gòu)，建系方法與評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參照Pritchard等[16]與Evanno等[17]的研究。具體參數(shù)設(shè)置：種群個(gè)數(shù)(K)預(yù)設(shè)為1～10，每一個(gè)K都運(yùn)行10次，初始不作數(shù)的迭代為10 000次，MCMC運(yùn)行100 000次，利用在線軟件STRUCTURE HARVESTER統(tǒng)計(jì)馬來穿山甲種群的最佳K值。根據(jù)分型結(jié)果使用Population 1.2.32構(gòu)建基于Nei氏遺傳距離[18]的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系

通過引物篩選、設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，獲得12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的3個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系(MP1、MP2和MP3；圖1)，每個(gè)位點(diǎn)的熒光產(chǎn)物峰強(qiáng)度大于1 000相對(duì)熒光單位(relative fluorescent units，RFU)。PCR擴(kuò)增的最適程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

圖1 復(fù)合擴(kuò)增體系Fig.1 Multiplex amplification system

2.2 復(fù)合擴(kuò)增體系的驗(yàn)證

12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在馬來穿山甲種群(n=135)中共檢出155個(gè)等位基因，所有等位基因組合成分型標(biāo)準(zhǔn)物。PAN_12和PAN_28位點(diǎn)的等位基因數(shù)量≤4個(gè)，而MJA05、MJA07、MJA13、MJA15和MJA27位點(diǎn)的等位基因數(shù)量均大于15個(gè)(附錄1)。

附錄1 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因及基因頻率

非父排除概率(probability of exclusion，PE)指非親子關(guān)系能被遺傳標(biāo)記排除的概率。PE-1P指兩個(gè)親本的基因型未知時(shí)的排除概率；PE-2P指當(dāng)一個(gè)親本的基因型已知的排除概率；PE-PP指兩個(gè)親本的基因型均已知時(shí)的排除概率。12個(gè)位點(diǎn)的累計(jì)P(ID)為6.48×10-16，P(ID)sibs為9.65×10-6，累計(jì)PE為0.999 8～0.999 9(表3)。體系內(nèi)的6個(gè)三、四核苷酸重復(fù)位點(diǎn)累積P(ID)為3.48×10-6，P(ID)sibs為9.7×10-3，便可滿足法醫(yī)非人類判別標(biāo)準(zhǔn)(P(ID)<0.001 0)[8]。

新構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增體系在相同條件下進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，所有馬來穿山甲樣本均能成功基因分型。在不同PCR儀器上擴(kuò)增的每個(gè)樣本在12個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上的基因型完全一致。盲測(cè)結(jié)果可以準(zhǔn)確地將30份樣本判定為源自20個(gè)不同個(gè)體，所有樣本僅需1次分型，準(zhǔn)確率為100%。

使用DNA濃度梯度進(jìn)行靈敏度測(cè)試。當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.5 ng/μL時(shí)，所有位點(diǎn)均能獲得準(zhǔn)確分型，最低峰強(qiáng)度為180 RFU，表明該復(fù)合擴(kuò)增體系內(nèi)所有位點(diǎn)能在微量的DNA檢材中得到準(zhǔn)確的分型結(jié)果(圖2)。

圖2 靈敏度測(cè)試Fig.2 Sensitivity test

對(duì)于穿山甲科其他物種，MJA12、MJL05和MJA15位點(diǎn)在樹穿山甲樣本中未檢測(cè)到信號(hào)；所有位點(diǎn)在大穿山甲樣本中檢測(cè)到信號(hào)；MJA12和MJA15位點(diǎn)在中華穿山甲樣本中未檢測(cè)到信號(hào)。對(duì)于非穿山甲科物種，馬(Equuscaballus)和白犀(Ceratotheriumsimum)有2個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到信號(hào)；家豬(Susscrofadomestica)有3個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到信號(hào)，牛(Bostaurus)、賽加羚羊(Saigatatarica)和東北兔(Lepusmandshuricus)都沒有檢測(cè)到信號(hào)(表4)。

表4 物種特異性分析

影子峰分析表明，三、四核苷酸重復(fù)位點(diǎn)相較于雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)在基因分型時(shí)更加保守、可靠性更高(表5)。分析影子峰產(chǎn)生的概率和影子峰占目的峰強(qiáng)度的平均值，可有效篩除峰強(qiáng)度明顯偏低的影子峰，從而最大限度消除影子峰對(duì)基因分型的影響。

表5 影子峰分析

2.3 種群遺傳分析

12個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到155個(gè)等位基因(附錄1)，各位點(diǎn)有效等位基因(Ne)為1.219～10.602，平均值為6.462，其中PAN_12位點(diǎn)有效等位基因數(shù)量最少，MJA15位點(diǎn)有效等位基因數(shù)量最多。各位點(diǎn)期望雜合度(He)為0.180～0.912，其中PAN_12位點(diǎn)最小，MJA15位點(diǎn)最大。各位點(diǎn)觀測(cè)雜合度(Ho)為0.140～0.822，其中PAN_12位點(diǎn)最小，MJA27位點(diǎn)最大(表6)。

表6 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性

分析135只涉案馬來穿山甲的種群遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。隨著假設(shè)種群數(shù)(K)增加，lnP(D)逐漸增加，而變化率逐漸減小，當(dāng)K在2～3變化時(shí)幅度最大。當(dāng)K=3時(shí)，lnP(D)的衍生值ΔK取最大值(25.6)，結(jié)合lnP(D)的變化趨勢(shì)和ΔK值，最終確定：K=3為最佳值，能反映待測(cè)種群的真實(shí)情況。將全部涉案?jìng)€(gè)體劃分為3個(gè)種群：MJ1、MJ2和MJ3。MJ3種群遺傳結(jié)構(gòu)較為單一，MJ1和MJ2種群則相對(duì)復(fù)雜，說明MJ1和MJ2種群間的基因交流相對(duì)較多，MJ3與其他種群間的基因交流較少。

圖3 馬來穿山甲結(jié)構(gòu)聚類Fig.3 Structure cluster diagram of 135 Malay pangolins 注：紅色表示MJ1種群；綠色表示MJ2種群；藍(lán)色表示MJ3種群 Note：The red individuals are from the population of MJ1.The green individuals are from the population of MJ2. The blue individuals are from the population of MJ3

NJ系統(tǒng)發(fā)育樹有類似結(jié)果(圖4)。MJ2和MJ3種群形成了獨(dú)立的亞支系，MJ1種群無獨(dú)立的亞支系，但與MJ2種群個(gè)體混雜一起，表明MJ1與MJ2種群間遺傳距離較近，MJ3與MJ1、MJ2種群間遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖4 基于12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳距離構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ tree based on genetic distance of 12 microsatellite locus 注：紅色表示MJ1種群；綠色表示MJ2種群；藍(lán)色表示MJ3種群 Note：The red individuals are from the population of MJ1.The green individuals are from the population of MJ2.The blue individuals are from the population of MJ3

MJ1種群有2個(gè)位點(diǎn)顯著偏離H-W平衡(P<0.01)，10個(gè)位點(diǎn)符合H-W平衡(P>0.05)。MJ2種群有5個(gè)位點(diǎn)顯著偏離H-W平衡(P<0.01)，6個(gè)位點(diǎn)符合H-W平衡(P>0.05)，1個(gè)位點(diǎn)偏離H-W平衡(0.010.05)，1個(gè)位點(diǎn)偏離H-W平衡(0.01

附錄2 哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)

固定指數(shù)(fixation index，F(xiàn)ST)可以體現(xiàn)種群間的遺傳分化程度：FST<0.05表示弱分化，0.05≤FST≤0.25表示中度分化，F(xiàn)ST>0.25表示高度分化。結(jié)果表明，MJ1和MJ2種群處于弱分化水平，MJ1和MJ2與MJ3種群分化程度較高，屬于中度分化(表7)。MJ1和MJ2種群的遺傳距離較近，二者與MJ3種群的遺傳距離較遠(yuǎn)，這與NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果相同。

表7 MJ1、MJ2和MJ3種群間固定指數(shù)和種群間遺傳距離

3 討論

3.1 位點(diǎn)篩選和個(gè)體識(shí)別體系重構(gòu)

ISFG建議非人類個(gè)體識(shí)別時(shí)優(yōu)先使用四核苷酸重復(fù)和復(fù)合擴(kuò)增方法[10]。本研究篩選了6個(gè)雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)和6個(gè)三、四核苷酸重復(fù)位點(diǎn)組成3個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系(MP1、MP2和MP3)。盡管雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)出現(xiàn)影子峰的概率較高，增加了基因分型的難度，但是分析影子峰峰強(qiáng)度與目的產(chǎn)物峰強(qiáng)度的比例，可以消除影子峰對(duì)分型的影響，提高基因分型的準(zhǔn)確度[19]。同時(shí)，MP1體系相對(duì)于MP2和MP3靈敏度更高，包含三、四核苷酸重復(fù)位點(diǎn)更多，其基因分型的優(yōu)勢(shì)更大。若檢材DNA質(zhì)量不佳，推薦優(yōu)先使用MP1進(jìn)行個(gè)體識(shí)別鑒定。

本研究重構(gòu)的馬來穿山甲個(gè)體識(shí)別體系具有較高的鑒別力，其P(ID)值和P(ID)sibs值遠(yuǎn)大于已發(fā)表的個(gè)體識(shí)別系統(tǒng)[5，7]。該體系內(nèi)6個(gè)三、四核苷酸重復(fù)位點(diǎn)組合便可滿足非人類個(gè)體識(shí)別的法醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(P(ID)<0.001)[8]。物種特異性分析表明，中華穿山甲和大穿山甲樣本中檢測(cè)出10個(gè)位點(diǎn)以上的特異峰，說明該體系經(jīng)大樣本驗(yàn)證后可適用于中華穿山甲和大穿山甲的個(gè)體識(shí)別和親緣關(guān)系鑒定。

鱗片是穿山甲非法貿(mào)易的主要部位，占比超過95%[3]。目前，在處理穿山甲鱗片非法貿(mào)易案件時(shí)，如何認(rèn)定個(gè)體數(shù)量是一大難題，主要通過穿山甲鱗片干重來評(píng)估盜獵個(gè)體數(shù)量，但鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究重構(gòu)的馬來穿山甲個(gè)體識(shí)別體系可有效對(duì)鱗片樣本進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，為解決上述難題提供了新方案。

3.2 種群遺傳分析

本研究計(jì)算的馬來穿山甲種群遺傳多樣性水平與前人的研究結(jié)果[4]相近，各位點(diǎn)He、Ho和PIC平均值的細(xì)微差異可能與選擇的位點(diǎn)和樣本數(shù)量差異有關(guān)(表8)。同時(shí)，馬來穿山甲種群遺傳多樣性水平與印度穿山甲[5]類似，大于中華穿山甲[5-6]和非洲的4種穿山甲[11-12]。非洲4種穿山甲種群遺傳多樣性水平與其分布范圍和種群數(shù)量呈正相關(guān)[12]。亞洲穿山甲中的中華穿山甲種群遺傳多樣性較低，應(yīng)該與其瀕危狀況和種群數(shù)量密切關(guān)聯(lián)。

表8 穿山甲科物種種群遺傳多樣性對(duì)比

Nash等[20]使用全基因組篩選的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism，SNPs)分析了83只馬來穿山甲的種群遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明這些馬來穿山甲可分為3個(gè)種群，分別來自婆羅洲、印度尼西亞爪哇島和新加坡或蘇門答臘島。本研究的馬來穿山甲種群遺傳結(jié)構(gòu)分析也得出了類似結(jié)果。但是，由于所用樣本為非法貿(mào)易查獲，無法追溯樣本來源地，不能據(jù)此推測(cè)該批樣本的原產(chǎn)地。依據(jù)非洲象牙的微衛(wèi)星個(gè)體識(shí)別體系可用于象牙產(chǎn)地追蹤[21]，可在國(guó)際上推廣利用本研究的馬來穿山甲個(gè)體識(shí)別體系構(gòu)建已知樣本數(shù)據(jù)庫(kù)，為非法貿(mào)易案件中穿山甲各類檢材來源地的鑒定奠定基礎(chǔ)。

總之，由12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)重構(gòu)的馬來穿山甲個(gè)體識(shí)別體系具有可靠性強(qiáng)、準(zhǔn)確率及靈敏度高和成本低等優(yōu)點(diǎn)，可適用于多種類型的檢材。同時(shí)，該體系可用于評(píng)估馬來穿山甲種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。

致謝：本研究試驗(yàn)樣本的采集得到了國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心的徐艷春教授、金煜教授、白素英副教授、馬躍工程師、王震工程師和劉微工程師的大力支持與幫助，在此一并致謝。