繅絲水對老齡大鼠氧化應(yīng)激水平的改善作用

覃輝艷,陳華鳳,楊 慧,羅海蘭,傅偉忠,李慶波,張潔宏

(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心,南寧 530028)

繅絲水是蠶繭加工成生絲過程中繅絲工序（蠶繭通過煮繭將繭絲脫去大部分絲膠）產(chǎn)生的廢水，每生產(chǎn)1 000 kg生絲將產(chǎn)生550～950 m3繅絲水［1］。繅絲水主要成分為絲膠和蠶蛹蛋白，含大量氮、磷等物質(zhì)，若直接排放，會使周圍水體在短時間內(nèi)迅速富營養(yǎng)化，導(dǎo)致水體腐敗變質(zhì)、發(fā)黑變臭，引起嚴(yán)重環(huán)境污染［2］。繅絲廠廢水處理主要有物理化學(xué)法和生物化學(xué)法，但兩者均成本較高且存在產(chǎn)生二次廢物的問題，達(dá)不到資源節(jié)約與可持續(xù)發(fā)展的要求［3］。若能對其進(jìn)行回收利用，不僅大大降低生產(chǎn)企業(yè)的廢水治理成本，且對環(huán)境保護(hù)和資源的循環(huán)利用具有重要意義。

目前對繅絲水回收利用的研究主要側(cè)重于從繅絲水中回收絲膠蛋白的工藝和方法，減少廢水的主要污染物質(zhì)蛋白質(zhì)的含量，并對其進(jìn)行有效利用以增加蠶繭的產(chǎn)品附加值，其間的廢水處理費用轉(zhuǎn)化為新產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。以往的研究表明，蠶絲可能是導(dǎo)致人類致敏的過敏原，繅絲工人在加工蠶絲的工程中，皮膚常暴露于蠶絲，其對絲質(zhì)過敏原的敏感率較高［4］。但是前期研究發(fā)現(xiàn)繅絲水經(jīng)口無毒副作用［5］，且具有增強人體免疫力［6］和降血脂［7］的作用，具有開發(fā)成為功能性新食品原料的可能。目前研究顯示，絲膠多肽具有2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基清除活性［8］，絲膠還可以抑制酪氨酸酶活性，并對過氧化氫和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼有明顯的清除作用［9］。

本研究模擬傳統(tǒng)繅絲工藝制備繅絲水，研究其對老齡大鼠氧化應(yīng)激的改善作用，為繅絲水的開發(fā)利用和人口老齡化相關(guān)重大疾病的預(yù)防控制提供重要的科學(xué)依據(jù)和研究數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 繅絲水樣品制備

本實驗使用的商業(yè)干蠶繭由廣西產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院提供。實驗前模擬傳統(tǒng)繅絲水產(chǎn)生過程進(jìn)行樣品處理：將蠶繭去除蠶蛹，稱量100 g除蛹蠶繭加水至3 L，浸泡0.5 h后小火煮沸1 h，其間不添加任何化學(xué)添加劑，用紗布過濾分離，以同樣方法重復(fù)提取一次，最后將兩次的濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1 000 mL，得到0.1 g/mL濃縮液，置于4℃冰箱保存，并按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行成分檢測，臨用前再用純水配制。根據(jù)實驗需要，使用同批次蠶繭，嚴(yán)格按相同的制備方法、設(shè)備和工藝多次進(jìn)行樣品制備，以保證樣品質(zhì)量的一致性和新鮮度。

1.2 實驗動物及環(huán)境

SPF級16月齡雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（856.0±103.7）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供［SCXK（桂）2014-0002］，實驗動物質(zhì)量合格證號為45000300000915。動物飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司［SCXK（京）2014-0010］提供。動物實驗室為屏障系統(tǒng)［SYXK（桂）2016-0002］，溫度22～25℃，相對濕度55%～70%。動物實驗方案經(jīng)過廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實驗動物管理與倫理委員會審查批準(zhǔn)，審查批號為20190004。

1.3 劑量選擇與樣品溶液配制

設(shè)500、250、125 mg/kg體質(zhì)量3個劑量組［6-7］，同時設(shè)一個陰性對照組，每組10只動物。分別量取樣品濃縮液50.0、25.0、12.5 mL，加純水至100 mL，混勻，配成50.0%、25.0%、12.5%濃度的高、中、低劑量組樣品溶液。

1.4 儀器與試劑

TECAN M200 PRO全自動酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；Sigma 4-16K高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）；日立L-8500A氨基酸分析儀（日本日立公司）；海能D100杜馬斯定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）。

丙二醛（malonaldehyde，MDA）、蛋白質(zhì)羰基、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化物酶（catalase，CAT）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 繅絲水成分分析

繅絲水成分檢測按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)［10-11］進(jìn)行。將受試樣品5 g溶于15 mL的6 mol/L HCl（質(zhì)量體積比為1:3），再加入0.2 mL苯酚，抽真空，在110℃恒溫干燥箱中水解22 h，使用日立L-8500A氨基酸分析儀進(jìn)行游離氨基酸和水解氨基酸分析。使用海能D100杜馬斯定氮儀進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測。

1.6 動物實驗

參照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的國食藥監(jiān)保化［2012］107號《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》［12］的附件1——抗氧化功能評價方法。受試?yán)淆g大鼠在屏障設(shè)施內(nèi)喂養(yǎng)觀察7 d，未見異常后取血測MDA含量。根據(jù)血清MDA含量將大鼠分層隨機分為3個受試樣品劑量組和1個陰性對照組，每組10只，并適當(dāng)調(diào)整，使各組的氧化水平和平均體質(zhì)量盡可能均衡。3個劑量組按照大鼠體質(zhì)量每100 g灌胃1.0 mL繅絲水的用量，分別經(jīng)口給予相應(yīng)濃度的樣品溶液；陰性對照組給予等體積的純水。每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30 d，并每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。

實驗結(jié)束時大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，取血和肝、腦組織，按照試劑盒方法測定脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量、蛋白質(zhì)羰基含量、GSH含量和抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）活性。

1.7 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Dunnett法，ɑ=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 繅絲水成分分析

繅絲水（0.1 g/mL濃縮液）中粗蛋白含量為1 640 mg/100 g，游離氨基酸含量為18 mg/100 g，水解氨基酸含量為1 700 mg/100 g。絲氨酸（30.59%）、門冬氨酸（18.82%）、甘氨酸（10.00%）和蘇氨酸（8.24%）是繅絲水中主要的水解氨基酸。色氨酸和牛磺酸含量均低于檢測限值（＜1.3 mg/100 g）（表1）。

表1 繅絲水氨基酸成分Table 1 Amino acid compositions of silkworm cocoon water

2.2 繅絲水對大鼠體質(zhì)量的影響

實驗前和實驗結(jié)束時繅絲水樣品各劑量組的大鼠體質(zhì)量與陰性對照組均無明顯差異（P＞0.05），表明該樣品對老齡大鼠的體質(zhì)量無明顯影響（表2）。

表2 實驗期間各組老齡大鼠的體質(zhì)量Table 2 Body weight of rats in each group during the experiment(±s)

表2 實驗期間各組老齡大鼠的體質(zhì)量Table 2 Body weight of rats in each group during the experiment(±s)

注：表中各時期各組大鼠的體質(zhì)量及增質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Note：There were no significant differences in body weight at different time points,and weight gain in each group(P＞0.05).

?

2.3 繅絲水對大鼠血清及組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA和蛋白質(zhì)羰基含量的影響

實驗前各組大鼠血清MDA含量無明顯差異（P＞0.05，圖1A）。實驗終末，繅絲水樣品高劑量組大鼠的血清、腦和肝組織MDA含量，以及中劑量組大鼠的血清MDA含量均低于陰性對照組（P＜0.05），表明該樣品具有降低老齡大鼠血清和組織中過氧化脂質(zhì)含量的作用（圖1A～D）。

實驗終末，繅絲水樣品高劑量組的血清和腦組織、中劑量組的腦組織蛋白質(zhì)羰基含量均低于陰性對照組（P＜0.05），表明該樣品具有降低老齡大鼠血清和組織中蛋白質(zhì)羰基含量的作用（圖1E～G）。

圖1 繅絲水對老齡大鼠血清和腦、肝組織中MDA和蛋白質(zhì)羰基含量的影響Figure 1 Effects of silkworm cocoon water on MDA levels and carbonyl contents in the serum，brain and liver of rats

2.4 繅絲水對大鼠血清及組織中GSH含量和GSH-Px活性的影響

實驗終末，樣品各劑量組的血清GSH含量和高、中劑量組的腦組織GSH含量均高于陰性對照組（P＜0.05），表明該樣品可以提高老齡大鼠血清和腦組織中谷胱甘肽的含量（圖2A～C）。

實驗終末，樣品高劑量組的血清、腦及肝組織和中劑量組的腦組織中GSH-Px活性均高于陰性對照組（P＜0.05），表明該樣品可以提高老齡大鼠血清和腦、肝組織中谷胱甘肽過氧化物酶的活性（圖2D～F）。

圖2 繅絲水對老齡大鼠血清和腦、肝組織中GSH含量和GSH-Px活性的影響Figure 2 Effects of silkworm cocoon water on GSH levels and GSH-Px activity in the serum,brain,and liver of rats

2.5 繅絲水對大鼠血清及組織中SOD和CAT活性的影響

實驗終末，樣品高、中劑量組大鼠肝組織中SOD活性均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明該樣品可以提高老齡大鼠肝組織中超氧化物歧化酶的活性（圖3A～C）。

實驗終末，樣品各劑量組大鼠肝組織中CAT活性和高、中劑量組的血清CAT活性均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明該樣品可以提高老齡大鼠血清和肝組織中過氧化氫酶的活性（圖3D～F）。

圖3 繅絲水對老齡大鼠血清及肝、腦組織SOD和CAT活性的影響Figure 3 Effects of silkworm cocoon water on SOD activity and CAT activity in the serum,brain,and liver of rats

3 討論

氧化應(yīng)激是指機體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，傾向于氧化，從而導(dǎo)致組織損傷。隨著年齡增長，活性氧等自由基清除變慢，鏈?zhǔn)降淖杂苫磻?yīng)使得核酸、蛋白質(zhì)和脂肪酸等大分子物質(zhì)發(fā)生變性和交聯(lián)，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物體的氧化應(yīng)激傷害，最終出現(xiàn)衰老［13］。氧化應(yīng)激不僅與衰老密切相關(guān)，且對糖尿病、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展起重要作用［14-15］。此外，高脂血癥［16］、神經(jīng)退行性病變［17］、阿爾茨海默病［18］、腫瘤等［19］疾病的發(fā)生發(fā)展都與體內(nèi)氧化應(yīng)激過度有關(guān)。

生物體內(nèi)的抗氧化防御體系由酶促抗氧化體系（如SOD和CAT等）和非酶促抗氧化體系（如GSH等）組成，二者可以消除活性氧，減輕氧化應(yīng)激損傷［20-21］。SOD可催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，CAT可催化過氧化氫分解成氧和水，而GSH-Px則能催化GSH變?yōu)檠趸凸入赘孰模╫xidized glutathione，GSSG），使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進(jìn)過氧化氫的分解，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害［20］。MDA和蛋白質(zhì)羰基則是脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物，MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，可引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，并具有細(xì)胞毒性［22］。蛋白質(zhì)羰基是自由基攻擊蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的一種不可逆的氧化修飾產(chǎn)物，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活、水解、折疊和交聯(lián)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能和機體代謝［23］。二者均可反映機體的氧化應(yīng)激損傷程度，是目前最常用的氧化產(chǎn)物標(biāo)志物。研究表明，人體血液中的蛋白質(zhì)羰基含量呈年齡相關(guān)性增加，蛋白質(zhì)氧化與血漿抗氧化能力呈顯著負(fù)相關(guān)［24］。MDA含量隨年齡的增長而增多，而SOD和GSH-Px含量則隨著年齡的增長而降低，且無性別差異，清除體內(nèi)過多的氧化自由基有助于延緩機體衰老［25-26］。

本研究從脂質(zhì)氧化產(chǎn)物（MDA）、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物（蛋白質(zhì)羰基）、抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）和抗氧化物質(zhì)（GSH）四個方面初步研究繅絲水改善老齡大鼠氧化應(yīng)激的作用。結(jié)果顯示：繅絲水可以降低老齡大鼠血清和組織中的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基含量，提高老齡大鼠血清和組織中抗氧化物質(zhì)GSH的含量、血清和組織中抗氧化酶CAT和GSH-Px、組織中抗氧化酶SOD的活性，表明繅絲水可改善老齡大鼠的氧化應(yīng)激。此外，實驗結(jié)果顯示：經(jīng)口給予繅絲水后，大鼠腦組織中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物均降低，GSH-Px活性和GSH含量均明顯增高，而SOD和CAT活性無明顯升高，提示繅絲水對腦組織的氧化應(yīng)激保護(hù)可能通過提高其非酶促抗氧化體系來實現(xiàn)。大鼠肝組織的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量降低，而SOD、CAT和GSH-Px活性均明顯升高（P＜0.05），但GSH含量無明顯增加（P＞0.05），提示繅絲水對肝組織的氧化應(yīng)激保護(hù)可能通過提高其酶促抗氧化體系來實現(xiàn)。另外從本實驗結(jié)果可以看出，無論在實驗動物的血清還是組織中，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物含量均隨著繅絲水劑量的增加而下降，抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)含量均隨著繅絲水劑量的增加而提高，提示繅絲水劑量越高，改善氧化應(yīng)激的作用越好，且在一定劑量水平時才具有明顯改善氧化應(yīng)激的作用。然而考慮到繅絲水的安全性，其所用劑量不應(yīng)超過其安全劑量；本課題組前期對其安全性研究發(fā)現(xiàn)，口服繅絲水90 d后雄性和雌性SD大鼠的未觀察到有害作用劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）為1 g·kg-1·d-1［5］。本研究所用繅絲水高劑量為NOAEL的1/2，提示在其安全劑量范圍內(nèi)，亦可表現(xiàn)出改善氧化應(yīng)激的作用。

繅絲水主要成分為絲膠和蠶蛹蛋白［2］，本研究對其氨基酸成分分析顯示，絲氨酸、門冬氨酸、甘氨酸和蘇氨酸是繅絲水中主要的水解氨基酸。這一結(jié)果與其他研究者對蠶絲中絲膠蛋白氨基酸組成分析的結(jié)果相似［27］。近年的研究顯示，絲氨酸、甘氨酸均具有抗氧化應(yīng)激的作用［28-30］。絲氨酸可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶AMPK和調(diào)控GSH合成相關(guān)基因的表達(dá)拮抗大鼠高脂肪飲食引起的氧化應(yīng)激［28］。絲氨酸能提高大鼠大腦中動脈栓塞后的腦內(nèi)SOD活性，降低MDA［29］。而甘氨酸是體內(nèi)GSH的組成氨基酸，可通過抑制糖尿病大鼠體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox4）的表達(dá)，增強GSH的合成，減輕腎臟氧化應(yīng)激［30］。繅絲水中氨基酸種類豐富，其中的絲氨酸、甘氨酸可能在抗氧化過程中發(fā)揮了重要的作用，其作用機制有待進(jìn)一步研究。

[醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動物實驗均已通過廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實驗動物管理與倫理委員會審查批準(zhǔn)（No.20190004）。所有實驗過程均遵照中國實驗動物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Welfare and Ethics Committee of Guangxi Center for Disease Control and Prevention(Approval Letter No.20190004).All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,includingAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892-2018),and so on.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

覃輝艷收集資料，設(shè)計研究方案，分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；陳華鳳開展樣品制備及參與抗氧化指標(biāo)檢測；楊慧負(fù)責(zé)成分分析檢測；傅偉忠和羅海蘭負(fù)責(zé)抗氧化指標(biāo)檢測；李慶波負(fù)責(zé)實驗動物灌胃及觀察；張潔宏指導(dǎo)整個實驗研究及論文審核。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。