HPLC波長切換法同時測定血脂靈片中7種成分的含量*

王艷萍，李 宏，李 鵬

（商洛市藥品檢驗所，陜西 商洛 726000）

血脂靈片是在中醫基礎理論指導下，由澤瀉、決明子、山楂、制何首烏4味中藥飲片按照中藥劑型工藝制備而成的中藥復方制劑。該制劑具有化濁降脂、潤腸通便的功效，用于臨床上的痰濁阻滯型高脂血癥，如頭暈胸悶、大便干燥等癥。2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）中收載了該處方中決明子和制何首烏的定量方法；鄭艷超等[1]和張華等[2]曾對該制劑中決明子藥材中的蒽醌類成分進行了定量分析。中藥發揮療效的固有特性是多組分、多靶點協同作用，而僅控制單一中藥有效成分群的含量，難以客觀、全面地評價產品的質量。

處方中的君藥澤瀉始載于《神農本草經》，被列為上品，其味甘性寒，主入腎、膀胱經，具有利水、滲濕、瀉熱、化濁降脂的功效，主治高血脂、小便不利、水腫脹滿、瀉痢、痰飲、嘔吐等病癥[3]。澤瀉的主要化學成分有三萜、倍半萜、糖類、黃酮、甾體、苯丙素等，其中三萜類成分（23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C等）具有降血脂、保肝、降血糖、抗結石、保護腎臟、抗癌、利尿、抗炎、抗氧化等藥理作用[4-12]。臣藥決明子性微寒，味苦甘咸，主入肝、腎、大腸經，有潤腸通便、降脂明目的功效，在治療高血壓、頭痛、眩暈、急性結膜炎、角膜潰瘍、青光眼、癰癤瘡瘍等病癥中有一定的療效。決明子主要化學成分為蒽醌類、吡酮類和脂肪酸類等成分，其中蒽醌類成分（橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等）具有降壓、清肝明目、瀉下、抑菌等藥理作用[13-18]。目前對血脂靈片中君藥（澤瀉）和臣藥（決明子）中所含的多種有效成分群含量進行同時測定的報道鮮見，故本研究旨在同時測定血脂靈片中7種化學成分的含量。

由于中藥復方中有效成分較為復雜，藥效物質基礎不明確，而品種、產地、加工方法等因素對單味中藥材的質量影響較大，使得中藥復方制劑的質量控制成為走向國際化的阻礙[19]。因此，在以臨床用藥的有效性和安全性的前提下，有必要建立快速、準確、全面的多種有效成分群的檢測分析方法。故本研究采用HPLC波長切換法建立了同時檢測血脂靈片中23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚7種有效成分的含量方法，旨在為全面控制與評價血脂靈片的質量提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器Waters e2695型HPLC色譜儀，配備PAD二極管陣列檢測器，四元梯度泵，Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；KQ5200 DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli Pore Advantage A10自動純水機（美國密理博公司）。

1.2 試劑與藥物23-乙酰澤瀉醇B對照品（批號：111846-201504，純度：95.0%）、橙黃決明素對照品（批號：111900-201202，純度：95.0%）、蘆薈大黃素對照品（批號：110795-201710，純度：98.3%）、大黃素對照品（批號：110756-201512，純度：98.0%）、大黃酚對照品（批號：110796-201621，純度：96.5%）、大黃素甲醚對照品（批號：110758-201013，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；23-乙酰澤瀉醇C對照品（批號：486-66-8，純度：98.0%）購自上海雅吉生物科技有限公司；血脂靈片共5批（批號：20190420、20190503、20190523、20190605、20190701，0.3 g/片）購自浙江天一堂有限公司；乙腈（色譜純）購自默克公司；其他試劑（分析純）購自天津化學試劑廠；純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫0～10 min，40%A；10～25 min，40%A→52%A；25～40 min，52%A→70%A；40～50 min，70%A；檢測波長：0～36 min時在284 nm波長下檢測橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，36～44 min時在208 nm波長下檢測23-乙酰澤瀉醇B，45～50 min時246 nm波長下檢測23-乙酰澤瀉醇C；柱溫：30℃；體積流量：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 混合對照品貯備溶液的制備分別精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對照品1.62 mg、23-乙酰澤瀉醇C對照品1.54 mg、橙黃決明素對照品2.67 mg、蘆薈大黃素對照品2.58 mg、大黃素對照品2.99 mg、大黃酚對照品2.57 mg、大黃素甲醚對照品2.08 mg分別置于同一100 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成質量濃度分別為15.39、15.09、25.37、25.36、29.30、24.80、20.76 μg/mL混合對照品貯備溶液。

2.3 供試品溶液的制備取20片血脂靈片，研成細粉，取約0.3 g，精密稱定質量，置50 mL的具塞錐形瓶中，精密量取25 mL的甲醇，緩緩加入后稱定總質量，水浴加熱回流60 min，放冷后再稱質量，補足減失的甲醇質量，搖勻，過濾。精密量取續濾液5 mL置具塞錐形瓶中，氮氣吹干，加10 mL的3.5 mol/L H2SO4溶液和20 mL的CHCl3溶液，加熱回流提取2 h，分取CHCl3液，水層用10 mL的CHCl3液振搖提取，合并提取液，用10 mL的水洗滌，棄去水層，CHCl3液水浴蒸干，殘渣轉移至容量瓶中，用甲醇-乙酸乙酯（2∶1）溶解并定容至5 mL，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備按本處方各藥材用量比例及制劑工藝流程分別制備缺決明子、制何首烏藥材陰性對照品，缺澤瀉藥材陰性對照品，再按“2.3”項下制備方法分別制備缺決明子、制何首烏藥材陰性對照溶液，缺澤瀉藥材陰性對照溶液。

2.5 系統適用性試驗精密吸取混合對照品貯備溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按照既定的HPLC-PDA進樣程序設置進樣，最后記錄50 min的HPLC色譜圖。（見圖1）結果顯示，23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚7個色譜峰的分離度均良好，結果顯示所建立的HPLC-PDA方法滿足本次實驗的測試要求。

圖1 HPLC圖

2.6 線性關系、定量限和檢出限分別精密吸取0.25、0.50、1.25、2.50、5.00mL的23-乙酰澤瀉醇B（質量濃度為15.390μg/mL）、23-乙酰澤瀉醇C（質量濃度為15.090 μg/mL）、橙黃決明素（質量濃度為25.370μg/mL）、蘆薈大黃素（質量濃度為25.360μg/mL）、大黃素（質量濃度為29.300 μg/mL）、大黃酚（質量濃度為24.800 μg/mL）、大黃素甲醚（質量濃度為20.760 μg/mL）混合對照品溶液，置于透明的容量瓶中，緩慢滴加甲醇溶液定容至5 mL刻度線，即可稀釋制成不同質量濃度的23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品溶液，然后依次按既定的HPLC-PDA色譜條件進樣10 μL定量分析，根據峰面積（A）計算各個成分的含有量。即23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚7種成分的質量（X，μg）為橫坐標，其各自的峰面積積分值（Y）為縱坐標，通過計算得出各自標準曲線的回歸方程與相關系數r。結果見表1，各成分的線性關系在其相應的質量濃度范圍內均有良好的線性關系。以3倍的信噪比（S/N=3）得出儀器檢出限和10倍的信噪比（S/N=10）得出儀器的定量限。

表1 7種化學成分線性關系、檢出限和定量限

2.7 精密度試驗取同一批次的血脂靈片樣品1份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法，連續測定6次后計算各成分的含量。23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量RSD分別為1.01%、1.06%、1.02%、1.15%、0.78%、1.23%、1.03%，表明本試驗儀器的精密度良好。

2.8 穩定性試驗取同一批次的血脂靈片供試品，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法，分別于0、2、4、6、8、12 h注入HPLC色譜儀。23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚各成分的峰面 積 的RSD為1.19%、1.02%、1.03%、0.94%、0.93%、1.12%、0.95%，表明樣品溶液中的7種成分在12h內均有良好的穩定性。

2.9 重復性試驗取同一批次的血脂靈片樣品共6份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法，分別進樣分析。23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量RSD分別為1.01%、1.01%、1.13%、0.99%、0.89%、1.02%、1.05%，表明建立的方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗取同一批次（批號：20190420）的血脂靈片樣品共9份，每份取約0.15 g，精密稱定后分別置于50 mL錐形瓶中，每組分別加入23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品貯備液，加入量為血脂靈片樣品中各成分含量的50%、100%和150%，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法進行色譜分析，并計算7種有效成分的加樣回收率。結果顯示，平均回收率分別為23-乙酰澤瀉醇B為99.98%（n=9，RSD=0.86%）；23-乙 酰 澤 瀉 醇C為101.29%（n=9，RSD=0.92%）；橙黃決明素為100.88%（n=9，RSD=1.10%）；蘆薈大黃素為99.98%（n=9，RSD=0.92%）；大黃素為101.50%（n=9，RSD=1.63%）；大黃酚為100.19%（n=9，RSD=0.55%）；大黃素甲醚為99.95%（n=9，RSD=0.60%）。（見表2）表明建立的試驗方法準確、可靠。

表2 加樣回收率試驗結果（n=9）

續表2：

2.11 含量測定取5個批次的血脂靈片樣品，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法進行色譜分析，并記錄50 min的色譜峰。計算23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量。（見表3）

表3 5批樣品中7種化學成分含量測定結果（mg/片，n=3）

3 討 論

3.1 測定指標成分的選擇血脂靈片是在中醫基礎理論指導下，經過中藥藥劑制備工藝精心制備而成的中藥復方，該方中各有效成分協同作用共同發揮療效[20]。筆者根據制劑配伍的君臣佐使原則，選擇可能發揮療效的君藥澤瀉（23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C）和臣藥決明子（橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）中的7種成分為測定指標，采用HPLC-PDA法同時定量分析了各有效成分在樣品中的含有量。結果顯示，7種有效成分在一定的HPLC-PDA方法下分離度均良好。

3.2 樣品處理方法和檢測波長的優選參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）中血脂靈片的處理方法處理樣品，結果發現該供試品溶液處理方法可使樣品中23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚提取完全。23-乙酰澤瀉醇B在波長208 nm處有吸收，23-乙酰澤瀉醇C在波長246 nm處有吸收，橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在波長284 nm處均有吸收。故本試驗選擇波長切換法同時對23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚7種有效成分的含量進行測定分析。

3.3 色譜條件的選擇試驗過程中分別對乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水3種流動相系統進行了對比，發現在乙腈-0.1%磷酸水流動相體系下進行梯度洗脫時，23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚7種成分之間色譜峰的分離度均大于1.5，分離效果較好；考察不同溫度（25℃、30℃、35℃）及不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對各有效成分色譜峰的分離效果，發現30℃的柱溫、1.0 mL/min的流速可以達到色譜分基線平穩、分離度和峰形較好的效果；考察不同品牌色譜柱，如Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridgeTMC18（4.6mm×250mm，5μm）、Thermo BDS-C18（4.6mm×250mm，5 μm），結果顯示Waters XBridgeTMC18柱能將7種指標性成分，即23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的色譜峰分開，并達到了良好的分離度。

3.4 樣品含量分析通過HPLC-UV波長切換法對5批血脂靈片中7種成分同時測定，結果顯示不同批次之間三萜類成分和蒽醌類成分差異較小，其中23-乙酰澤瀉醇B含量最低，為0.050 9～0.057 3 mg/片；23-乙酰澤瀉醇C含量為0.053 5～0.058 8 mg/片；橙黃決明素含量為0.205～0.211 mg/片；蘆薈大黃素含量為0.231～0.255mg/片；大黃酚含量為0.198～0.211mg/片；大黃素甲醚含量為0.209～0.228 mg/片；大黃素含量最高，為0.312～0.342 mg/片。5批樣品均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）中規定的血脂靈片每片含大黃素（C15H10O5）不得少于0.15 mg。

4 小 結

本研究建立了HPLC-UV法同時測定血脂靈片中23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的方法，并對HPLC分離參數進行了一系列的方法學考察，優化得出最理想的HPLC色譜分離方法，表明本次方法同時測定血脂靈片中不同有效成分的含量，結果較為準確、可靠。本研究首次對血脂靈片君藥（澤瀉）和臣藥（決明子）中的有效成分同時進行測定，不僅可為血脂靈片內在質量有效評價提供參考，同時也為其他中藥復方制劑的質量控制與評價提供借鑒。