基于中醫傳承輔助平臺與網絡藥理學探析中醫治療肺炎的組方配伍規律及作用機制*

楊皓博，周銘晗，范文濤

（陜西中醫藥大學基礎醫學院，陜西 咸陽 712046）

肺炎（pneumonia）是指終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，可由病原微生物、免疫損傷及藥物等因素所致。其中細菌性肺炎和病毒性肺炎占了多數，肺炎患者通常表現為肺部濕啰音，呼吸急促，嚴重者可出現持續性高熱、心悸、急性呼吸窘迫綜合征[1]。中醫學無“肺炎”病名，按照咳嗽、喘證辨證論治，常見證型有風寒束肺、風熱犯肺、熱毒熾盛、熱毒壅肺等。本研究運用中醫傳承輔助平臺對《中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑手冊》中治療肺炎的處方進行歸納、整理，分析配伍規律，篩選核心處方及核心藥物，然后進一步采用網絡藥理學分析核心處方治療肺炎的作用機制，旨在為臨床治療提供依據。

1 數據資料

1.1 處方來源與處方篩選 本研究使用中醫傳承輔助平臺（V2.5）對《中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑手冊》進行分析。《中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑手冊》由中華人民共和國衛生部藥典委員會于1993年編著，它規范了中成藥的質量標準和主流中成藥在臨床使用標準[2]，且共收錄了4 000余種中成藥。在平臺中的西醫診斷中輸入“肺炎”進行搜索，篩選出治療肺炎的有效處方。

1.2 數據分析 通過軟件平臺中的“數據分析”模塊，挖掘中醫藥治療肺炎的用藥規律。運用規則分析、頻數規律等數據挖掘方法，即使用“復雜系統熵聚類”“組方規律”等功能，得到治療肺炎的組方中各個藥物之間的使用頻數及藥物的關聯規則。

1.3 基于網絡藥理學的作用機制分析 通過藥物頻數統計、基于關聯規則的組方規律篩選治療肺炎的最佳處方，將所獲得的中藥輸入TCMSP數據庫，得出有效化合物成分及藥物作用靶點，并且從GeneCards數據庫中獲取肺炎的疾病靶點基因，導入到R4.1.1數據包得到藥物與疾病的靶點交集，輸入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網絡，并進一步進行網絡拓撲分析。

1.4 靶點的通路分析 為了解所篩選出的蛋白基因的功能以及其在肺炎疾病信號通路中的作用機理，首先將所有靶基因名稱通過Uniprot網站校正為其官方名稱，將篩選得到的靶點導入R4.1.1數據包；然后通過輸入所有靶標基因名稱并將物種限制為人類，經上述數據庫檢索和轉化操作，設定顯著性程度P＜0.01；最后進行GO生物學過程富集分析和KEGG信號通路富集分析將其分析結果進行可視化。

2 結果

2.1 證候統計 運用平臺對肺炎進行中醫證候分析并做統計。熱毒熾盛證6次，痰熱蘊肺證5次，熱毒蘊腸證5次，風熱犯肺4次，肺熱壅盛4次，溫毒犯表3次，熱毒攻喉3次，風熱犯表3次，風熱壅盛2次，心血瘀阻2次。（見圖1）

圖1 證候頻數圖

2.2 藥物性味歸經分析 運用軟件平臺中“統計報表”系統模塊中的“性味歸經統計”功能。對篩選出的34首處方中藥物所涉及的性味、歸經進行統計。其中藥性以寒、溫為主，藥味以苦、甘、辛為主。歸經以肺經（109次）、胃經（80次）、心經（69次）、脾經（45次）為主。（見圖2～4）

圖2 藥物四氣頻數圖

圖3 藥物五味頻數圖

圖4 藥物歸經頻數圖

2.3 用藥頻數分析 經分析得到可以治療肺炎方劑有34首，共包含中藥99味，用藥頻數在4次以上的共15味。排名前5味藥分別是黃芩、石膏、甘草、金銀花、苦杏仁。（見表1）

表1 用藥頻數≥4 的中藥

2.4 藥物關聯規則分析 分析得到的34首處方之間的關聯情況，使用網絡化展示得出用藥模式；選擇“規則分析”選項，置信度選擇0.8以上，所分析得到組合的藥物組合關聯規則見表2。

表2 藥物組合關聯規則

2.5 中藥處方基于關聯規則的組方規律 點擊“組方規律”進行系統分析，并將支持度設置為5，置信度設置為0.6，根據藥物組合的頻數進行排列，共得到13種用藥模式。（見表3）使用“新方聚類”功能得到10個核心組合。（見表4）

表3 常用藥物用藥模式

表4 用于熵聚類分析核心組合

2.6 核心處方及新方分析

2.6.1 核心處方分析 基于無監督的熵層次聚類分析，分別采用支持度為3、置信度為0.7，支持度為4、置信度為0.6，支持度為5、置信度為0.6，分析治療肺炎的核心處方。最終獲得治療肺炎的核心組方為麻杏甘石湯加黃芩，進一步通過網絡藥理學分析麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的作用機制，為臨床應用提供依據。關聯網絡展示圖見圖5。

圖5 不同支持度下關聯規則網絡化展示

2.6.2 新方分析 進一步將相關度設置12，懲罰度為2，篩出5個治療肺炎的新處方。（見表5）

表5 基于熵層次聚類的新處方

2.7 所獲取的核心藥物的有效成分和作用靶點 支持度為5，置信度為0.6時可得到麻杏甘石湯加黃芩的治療肺炎核心藥物。將麻黃、苦杏仁、生石膏、甘草、黃芩輸入TCMSP數據庫，通過生物利用度（OB）＞30%及類藥性（DL）＞0.18篩選得到麻黃23個有效成分，苦杏仁19個有效成分，甘草92個有效成分，黃芩36個有效成分，生石膏數據庫均無有效成分和靶點記錄在庫，通過查找文獻獲得其有效成分，故統計出170個有效成分。麻杏甘石湯加黃芩中部分有效活性物基本信息見表6。

表6 麻杏甘石湯加黃芩中部分活性化合物基本信息

2.8 藥物化合物作用靶點網絡圖 將所得出的有效化合物和靶點導入Cytoscape3.8.0并繪制網絡圖，得到包括有效化合物241個節點和1 025條邊，每條邊表示化合物分子與靶點之間的潛在作用關系。（見圖6）

圖6 麻杏甘石湯加黃芩潛在化合物-作用靶點網絡圖

2.9 蛋白互作分析和網絡拓撲分析 將篩選得到的基因輸入Cytoscape3.8.0中BisoGenet中繪制出蛋白互作網絡（PPI），共得到2 980個節點，67 895條邊。（見圖7）使用CytoNCA插件對整體網絡進行網絡拓撲分析，還提出了度（degree）和介數（betweenness）等一系列可定量刻畫網絡內部結構的度量，選擇DC模式，并選擇最小值61篩選得到網絡圖，篩選后共得到680個節點，26 194條邊。將所得到的網絡圖放大后選擇BC模式，選擇最小值600篩選得到網絡圖，篩選后共得到149個節點，3 636條邊，最后放大得到圖8。其中IL-6、AKT1、GSK3B、MAPK1、MAPK3、CDK2、CASP3、JUN及RELA等是麻杏甘石湯加黃芩主要活性成分的潛在靶點蛋白。

圖7 麻杏甘石湯加黃芩蛋白質互作網絡圖

圖8 麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的網絡拓撲分析圖

2.10 高頻藥物的GO分析和KEGG分析

2.10.1 高頻藥物GO分析 通過使用R4.1.1數據包對所篩選出的基因列表進行GO富集分析功能，選取P＜0.01的20條通路得到氣泡圖。（見圖9）分子功能中排名前3的分別是DNA結合轉錄因子結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合。生物過程排名前3的分別是細胞對化學應激的反應、對氧化應激的反應和對類固醇激素反應。細胞成分排名前3的是膜筏、膜微區和富含ficolin-1顆粒腔。

圖9 麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的GO 富集分析

2.10.2 KEGG分析 通過KEGG通路富集篩選得到146條信號通路，故選取P＜0.01的20條通路。（見圖10）這些基因在MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、p53信號通路（p53 signaling pathway）及Jak-STAT信號通路（Jak-STAT signaling pathway）上富集的較多。（見圖11～13）

圖10 麻杏甘石湯加黃芩作用靶點KEGG 富集分析的20 條通路

圖11 Jak-STAT 信號通路圖

圖12 p53 信號通路圖

圖13 MAPK 信號通路圖

3 討論

中醫傳承輔助平臺結合了網絡科學的方法和技術，可應用于總結名老中醫的經驗，總結特定疾病的用藥規律，篩選用藥頻數最高的核心藥物，從而指導新藥研發并進行整理分析，有利于現代中醫的創新傳承[3]。中藥是一種多靶點、多組分的藥物，中藥復方更是如此。網絡藥理學是生物信息學中十分重要的組成部分，是非常注重整體性和系統性的新興學科[4]。網絡藥理學可對中藥復方治療疾病的機制及通路做出可視化分析，是進一步發展中醫藥產業的新方法[5]。

3.1 中醫傳承輔助平臺組方配伍分析 本研究運用中醫傳承輔助平臺對《中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑手冊》中所記載的處方進行篩選，最終篩選出治療肺炎的中藥復方34首。治療肺炎所應用的中藥以寒性藥、溫性藥為主，其中寒性藥頻數為115次（70.55%），溫性藥頻數為25次（15.33%）。寒涼藥多有清熱、解毒、瀉火的功效，在治療肺炎里起到了清肅肺氣的作用。溫性藥多有溫中、散寒、助陽、補火等作用，在治療肺炎中起到了溫肺化飲的作用。篩選出的藥物多歸肺、胃、心、脾經。其味以苦、甘、辛味為主，其中苦味藥頻數為97次（40.58%），甘味藥頻數為69次（28.87%），辛味藥頻數為56次（23.43%），味苦以降肺氣、味甘以補肺氣、味辛以宣肺氣[6]。熱毒熾盛證出現6次，痰熱蘊肺證5次，熱毒蘊腸證5次，即肺炎的發生多與“熱，毒，痰”有關。這與張利民等[7]關于肺炎證候研究的結果基本一致。麻杏甘石湯主治邪熱壅肺證，而黃芩能清熱燥濕，解氣分之熱，清上焦實熱，即解熱毒熾盛之熱[8]。

藥物頻數分析顯示，最常使用的中藥中前5味藥分別是黃芩（15次），石膏（9次），甘草（8次），金銀花（8次），苦杏仁（8次）。黃芩味苦，性寒，能清上焦之火，燥濕解毒。黃芩是《活人方》中所著清金丸的君藥[9]，其主治肺金枯燥，氣逆喘嗽，臟腑實火內熾與現今肺炎疾病類似。研究表明，黃芩苷可用于治療肺炎、腫瘤及肝炎等疾病[10]。苦杏仁性微溫，味苦，歸肺經、大腸經。其主要用于治療肺氣上逆、反復咳喘不愈、大便干結。苦杏仁為止咳平喘要藥。苦杏仁的甲醇提取物苦杏仁苷可以通過分解成氫氰酸發揮鎮咳、平喘、抑制呼吸中樞的作用，從而治療肺炎[11]。甘草甘，平，歸心、肺、脾、胃經，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳的功效。甘草中甘草酸的抗病毒作用較強，對肺炎有一定治療作用。楊曉露等[12]的研究證實了甘草總黃酮能有效抑制細胞上清中一氧化氮（NO）產物亞硝酸鹽含量，下調激活巨噬細胞中iNOS、COX-2的水平，抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）中的細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路，上調PPAR-γmRNA的表達，從而達到抗炎效果[13]。金銀花味甘性寒，歸肺、胃經，主清熱解毒。金銀花具有抗炎、清熱、抗病毒等多重藥理作用。金銀花水提液及金銀花醇對流感病毒有明顯抑制作用[14]。石膏味甘、辛，性大寒，歸肺、胃經，主清熱瀉火、除煩止渴。現代藥理研究[15]表明生石膏中富含Ca2+，可以通過抑制神經肌肉的興奮性和調節血管通透性，來達到解痙及抗炎的作用，并且還對體溫調節中心有抑制作用，可以解熱而不出汗。麻黃性溫，味辛、微苦，歸肺、膀胱經。麻黃的水煎劑、水提物和揮發油均有很好的解熱、平喘、鎮咳，抗炎等作用，麻黃中所含的麻黃堿、偽麻黃堿可以通過興奮支氣管平滑肌的β受體來松弛平滑肌，并興奮黏膜血管平滑肌α受體來收縮血管，以達到平喘的目的[16]。

本研究篩選出的核心處方為麻杏甘石湯加黃芩。麻杏甘石湯首出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治法》[17]，后世醫家多將其用于風寒化熱，或風熱犯肺，或見肺中熱盛，身熱喘咳，口渴脈數等證的治療。麻杏甘石湯具有清涼解表、清肺平喘的功效，是治療肺炎的常用方劑。

3.2 網絡藥理學分析核心處方的作用機制 麻杏甘石湯加黃芩化合物成分、靶標基因與疾病靶點之間具有50個交集靶點，中心靶點為IL-6、AKT1、GSK3B、MAPK1、MAPK3、CDK2、CASP3、JUN以及RELA。IL-6具有多種生物學功能，是急性時相反應的有效誘導劑。IL-6在B細胞最終分化為參與淋巴細胞與單核細胞分化的免疫球蛋白分泌細胞中起重要作用[18]。同時IL-6也是肺炎診療方案臨床的重要指標[19]，對肺炎的治療起重要作用。這些靶點可能是麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的關鍵靶點及作用機制之一。GO富集分析結果顯示，麻杏甘石湯加黃芩可能通過影響與DNA結合轉錄因子結合的蛋白質，與基因調控區內的特定DNA序列相互作用以調節轉錄，通過調節特定DNA序列的轉錄表達達到防治肺炎的目的。KEGG通路富集分析篩選得到了MAPK信號通路、p53信號通路及Jak-STAT信號通路等信號通路。其中MAPK通過激活NF-κB的活性，可以使促炎性細胞因子大量釋放，還可通過JNK激活c-Jun來控制細胞凋亡[20]。p53信號通路由多種應激信號誘導，能使PKB/Akt通過去磷酸化激活NF-κB的活性，通過DNA調節COX-2活性來促進血管生成[21]。Jak-STAT信號通路可以通過與MAPK信號通路的級聯反應，進一步介導炎癥和免疫調節等作用[22]。這些作用靶點與通路相互影響，可能是麻杏甘石湯加黃芩治療肺炎的可能作用機制之一，其具體作用機制有待繼續探討。