維生素B6對非小細胞肺癌的放療增效作用

司少艷，申玉龍，秦亞亞，吳瑩瑩，王宗燁，宋淑軍#

戰略支援部隊特色醫學中心1綜合基礎研究室，2放療科，北京 100101

肺癌目前是世界上也是中國腫瘤死亡人數最多的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%以上[1]。目前肺癌的治療以綜合治療為主，其中放療是重要的治療手段之一。然而，射線殺死腫瘤細胞的同時也會產生不良反應，導致并發癥，此外，腫瘤細胞的放射抵抗或不敏感是影響放療效果的重要因素。因此，為了提高療效，減少并發癥及射線的抗性，開發具有放療增效作用的藥物，提高輻射對NSCLC細胞的毒性，減少不良反應，增加放射敏感性，對改善腫瘤患者的臨床預后具有非常重要的意義。理想情況下，無毒而且能夠增強輻射對腫瘤細胞殺傷作用的化合物為首選，因此，無毒副作用的天然產物逐漸得到人們的關注。維生素是維持人體正常功能所必需的營養素，在新陳代謝過程中發揮著重要作用。維生素B6（vitamin B6，VB6）是一種水溶性維生素，由含有2-甲基-3-羥基吡啶結構的6種化合物組成，分別為吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）、吡哆醛（PL）及磷酸化衍生物5'-磷酸吡哆醇（PNP）、5'-磷酸吡哆胺（PMP）和5'-磷酸吡哆醛（PLP），這6種化合物可相互轉換。PLP是VB6的活性形式，作為一種輔酶，在體內參與160多種不同的生化反應，對維持人體正常生理機能具有重要意義，VB6的缺乏或代謝異常與包括腫瘤在內的多種臨床疾病有關[2]。越來越多的研究顯示，VB6缺乏與腫瘤之間存在一定的關聯，VB6攝入量和血液PLP水平與結直腸癌發生風險均呈負相關[3]。有學者報道，VB6攝入和高血漿PLP水平可以作為胰腺癌的保護因子[4]。VB6缺乏還與肺部腫瘤發生風險有關[5]，膳食VB6可以通過抑制腫瘤細胞的增殖，減少氧化應激、一氧化氮生成和血管生成，促進腫瘤細胞的凋亡以及增強免疫反應來抑制腫瘤的發生[6-7]。盡管關于VB6的抗腫瘤效應的報道較多，但VB6是否具有放療增效以及增敏作用尚不清楚。本研究通過觀察VB6與X線聯合使用對肺癌A549細胞存活作用的影響，了解VB6與X線對NSCLC細胞的協同殺傷效應及放療增效作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC細胞A549由美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）細胞庫提供。RPMI1640細胞培養基購自美國GE醫療生命科學公司，胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司，瑞氏-姬姆薩染液購自北京雷根生物技術有限公司。VB6購自河南潤弘制藥股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養 采用改良的RPMI1640培養液，含有10%胎牛血清以及青霉素和鏈霉素各100 U/ml，在37℃、5% CO2空氣中進行細胞培養，每2～3天換液一次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞照射 采用AXESSE直線加速器，6 MV X線照射，照射源軸距為100 cm。單次照射劑量分別為0、2、4、6 Gy，劑量率為4 Gy/min。

1.2.3 細胞克隆形成實驗 將A549細胞稀釋成單細胞懸液，然后接種于6孔板中，每孔200個細胞，待4～6 h細胞貼壁后，用含有不同濃度的VB6培養基處理細胞，分別設置為低濃度組（125 μg/ml）、中濃度組（250 μg/ml）、高濃度（500 μg/ml）以及對照組（0 μg/ml），藥物處理8天后，用4%的多聚甲醛進行固定，瑞氏-姬姆薩染液進行染色。部分細胞待VB（60、250 μg/ml）處理細胞1天后，進行X線照射，然后在培養箱中繼續培養，用含原相同濃度的VB6培養基每2～3天換液一次，藥物處理8天，于照射后第8天（照射后滿7天），將細胞固定并染色，然后在顯微鏡下觀察，對細胞克隆（≥50個細胞的細胞團）進行計數，計算克隆形成效率和存活分數，克隆形成效率=每孔的克隆數/每孔接種細胞數×100%，存活分數=處理組的克隆數（/該組每孔接種細胞數×對照組的克隆形成效率）×100%。

1.2.4 藥物增敏作用 藥物的輻射增敏作用可以通過輻射增強比值（radiation enhancement ratio，RER）來判定。RER（xGy）=單獨X線處理細胞的存活分數/VB6聯合X線處理細胞的存活分數，RER大于1表示藥物有放射增敏作用[8]，該比值越大說明VB6對射線的增效作用越強。

1.2.5 藥物相互作用評價 兩種藥物或治療方法合并使用時，可產生不同的效果，相互作用結果可以通過相互作用系數（coefficient of drug interaction，CDI）進行判斷，根據Cohen等[9]介紹的方法，CDI=AB（/A×B）。A為單獨VB6處理細胞后的存活率，B為X線單獨作用于細胞后的存活率，AB為VB6與X線聯合作用于細胞后的存活率。CDI=1為兩者作用相加，即聯合治療所得療效為兩種藥物或療法的療效之和；CDI＞1為拮抗作用，即聯合治療所得療效比兩種藥物或療法的療效之和小；CDI＜1為協同作用，即聯合治療所得療效比兩種藥物或療法的療效之和大，CDI＜0.7為顯著的協同作用。為了減少偏差，CDI相加作用的判斷可擴展至0.9～1.1。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計數資料以-例數及率（%）表示；計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗；VB6與X線的交互作用采用析因分析法；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VB6對A549細胞克隆形成能力的影響

VB6呈劑量依賴性地抑制A549細胞克隆形成，隨著VB6濃度升高，細胞克隆數逐漸減少，克隆形成效率及存活分數均逐漸降低（P＜0.05）。中濃度組、高濃度組A549細胞克隆數、克隆形成效率及存活分數均低于對照組，中濃度組、高濃度組A549細胞克隆數、克隆形成效率及存活分數均低于低濃度組，高濃度組A549細胞克隆數、克隆形成效率及存活分數均低于中濃度組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 VB6對A549細胞克隆形成能力的影響（±s）

表1 VB6對A549細胞克隆形成能力的影響（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與低濃度組比較，P＜0.05；c與中濃度組比較，P＜0.05

組別對照組低濃度組中濃度組高濃度組F值P值1 3 0.3±9.6 1 2 4.0±5.0 1 0 6.7±6.5 a b 8 0.3±7.5 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5 6 5.2±4.8 6 2.0±2.5 5 3.3±3.3 a b 4 0.2±3.8 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5 1 0 0.0±7.4 9 5.1±3.8 8 1.8±5.0 a b 6 1.3±5.7 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5克隆數克隆形成效率（%）存活分數（%）

2.2 VB6對放療的增效作用

X線照射后A549細胞克隆形成數量減少，克隆形成效率降低，X線呈劑量依賴性地抑制細胞克隆形成，2、4、6 Gy照射組細胞存活分數分別較未照射組細胞下降了49.1%、78.0%和97.2%（F=487.410，P＜0.01）。VB6與X線聯合處理細胞，可使X線照射對細胞存活的抑制作用更為明顯，VB6（250 μg/ml）與2、4、6 Gy的射線聯合處理細胞的存活分數進一步下降，與未照射組比較，分別下降了63.2%、87.0%和99.0%（F=3.997，P＜0.01）。雖然250 μg/ml的VB6單獨處理細胞使A549細胞的存活分數只下降18.2%，但其與2 Gy的射線聯合處理細胞則可使細胞的存活分數較單獨照射組進一步下降14.1%。X線×VB6析因分析發現，VB6和X線均能降低細胞的存活分數，且兩者有明顯的交互作用。（表 2）

表2 X線單獨-及與VB6聯合治療對A549細胞存活分數的影響（%，±s）

表2 X線單獨-及與VB6聯合治療對A549細胞存活分數的影響（%，±s）

注：a與0 Gy比較，P＜0.05；b與2 Gy比較，P＜0.05；c與4 Gy比較，P＜0.05

方法X線X線+V B 6 1 0 0.0±7.4 8 1.8±5.0 5 0.9±5.0 a 3 6.8±4.7 a 2 2.0±4.2 a b 1 3.0±2.3 a b 2.8±0.4 a b c 1.0±0.4 a b c 0 G y 2 G y 4 G y 6 G y

2.3 藥物相互作用

VB6與2、4、6 Gy X線相互作用的CDI分別為0.88、0.72和 0.44，均小于 1，說明 VB6和 X 線對A549細胞具有協同抑制作用，而非簡單的相加作用，而且射線劑量為4 Gy和6 Gy時協同作用比2 Gy時更顯著。此外，VB6（250 μg/ml）對2、4、6 Gy劑量射線的RER分別為1.38、1.69和2.75，均大于1，說明VB6對X線抑制細胞存活效應有明顯增效作用，具有輻射增敏作用。

3 討論

VB6作為人體必需的一種維生素，在體內參與多種物質的代謝，對維持人體正常的生理機能具有重要意義。VB6的缺乏或代謝異常與包括腫瘤在內的多種疾病的發生有關[2]。盡管研究結果不一致，但越來越多的研究顯示VB6可能與多種腫瘤的發生有關，如胃腸道癌[3]、胰腺癌[4]、乳腺癌[10]和前列腺癌[11]等。對于全球腫瘤死亡人數最多的肺癌，與VB6同樣存在著一定的關聯，一項包括8000多例肺癌患者的薈萃分析研究顯示，VB6缺乏與肺部腫瘤的增加有關[12]。另外一項大規模人群研究結果表明，血清VB6水平與NSCLC的發生風險呈負相關[13]。然而，調查研究結果并不完全一致，一項研究發現VB6只與歐洲和亞洲吸煙的男性肺癌患者具有微弱關聯[14]。而前瞻性隊列研究并未發現血清VB6與肺癌發生風險之間存在關聯[15]，因此，有關VB6與肺癌之間的關系仍有待于進一步的研究。本研究結果顯示，VB6在體外呈劑量依賴性地抑制A549細胞克隆形成，500 μg/ml的 VB6可以使細胞存活分數下降近40%，說明VB6使該細胞的存活能力受到明顯抑制，該研究結果支持VB6對NSCLC具有抑制作用。NSCLC患者的紅細胞VB6水平降低[16]，吡哆醛激酶（一種將VB6前體轉化為PLP的酶）的水平升高已被證明是NSCLC患者良好的、獨立于治療的預后標志物[17]，這些研究結果表明VB6可能是NSCLC的保護因子。

VB6除了本身具有一定的抗腫瘤活性外，與化療藥物聯合使用具有增強藥物對腫瘤細胞毒性的作用，體外實驗顯示PN在多種腫瘤細胞系（NSCLC、卵巢癌、宮頸癌、骨肉瘤、間皮瘤、結直腸癌以及多個不同的順鉑耐藥細胞系）中可增強順鉑對細胞的毒性作用[17]。在NSCLC小鼠模型中，進行腫瘤內注射PN同樣可以增強化療藥物順鉑的抗腫瘤作用，VB6可以增強順鉑對A549細胞的細胞毒性作用，加劇順鉑導致的DNA損傷[17]。有報道使用一種昆蟲源性中藥斑蝥酸鈉和VB6的組合，與鉑類化療藥物聯合使用，能提高NSCLC的治療效果，減少腫瘤復發和化療不良反應，改善患者的生活質量和免疫功能[18]。然而，目前有關VB6對放療增效作用的報道很少，有學者發現PN可以使A549細胞對高劑量（50 Gy）γ-射線的敏感性增強[17]，然而，射線的種類及放射劑量不同，藥物的影響會有很大差異[19]。本研究結果顯示，在X線照射劑量為2、4、6 Gy時，VB6可以增強X線對A549細胞的抑制作用，不同劑量射線與VB6聯合使用均較兩者單獨使用的抑制作用增強，CDI均小于0.9，說明VB6與X線聯合使用對A549細胞具有協同抑制作用，而非單純的疊加效應，特別是在4 Gy和6 Gy時CDI更低，說明協同抑制作用更顯著，聯合治療顯示出比單一治療更大的細胞效應。因此，NSCLC放療過程中適當補充VB6有可能對增強NSCLC的放療效果具有一定的幫助。

此外，本研究結果還顯示VB6（250 μg/ml）對2、4、6 Gy劑量射線的RER均大于1，說明VB6具有一定的放療增效作用。放射抵抗是影響腫瘤放療效果的直接因素，提高腫瘤的放療敏感性是醫學研究的熱點課題，放療增敏劑能夠增強射線對腫瘤細胞的殺傷作用，提高腫瘤細胞對放療的敏感性，提高腫瘤的放療效果，因此，VB6的放療增效作用值得進一步探討。

VB6不僅可以直接抑制NSCLC細胞的存活，而且與X線聯合應用起到協同抑制以及輻射增敏作用，VB6的這些特性有可能使其成為NSCLC放療過程中聯合治療的候選化合物。