中國白酒氨基甲酸乙酯形成的代謝機制及控制技術研究進展

唐云容，楊軍林

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州習水 564622）

白酒作為我國一種技藝傳承上千年的蒸餾酒，其自然接種、長時間、開放式的固態發酵方式，造就了不同于西方蒸餾酒純種液態發酵的風格特征。氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）對人類具有潛在的致癌風險，國際癌癥研究署已將其劃歸為2A類致癌物。加拿大于20世紀80年代首次規定以谷物為釀酒原料的蒸餾酒中EC 含量≤150μg/L，隨后歐美等國亦規定了EC 的限量，但我國尚未制定白酒中EC 的限量標準。近年來世界多地多種發酵食品及飲料酒中均檢出不同濃度的EC。因此，各國食品安全及與人類健康相關的研究機構開展了針對酒中EC 的限量標準的制定和風險評估，積極探索和尋找降低或消除EC含量的控制措施。

國內外科研人員開展了EC 在白酒發酵、蒸餾及貯存過程中的代謝機制研究，以明晰EC 的生成途徑，為控制EC 含量提出具有實踐性的相關措施。充分認識我國白酒中EC 含量分布、風險暴露情況，有助于為制定其限量標準提供數據支撐。當前，研究人員通過物理化學、酶學及代謝工程等技術手段對我國白酒發酵、蒸餾及貯存過程中EC 含量的控制措施進行了大量研究工作。鑒于我國白酒尚未建立EC限量標準，深入開展白酒中EC形成的代謝機制、控制措施、風險評估等方面研究對保障消費者身體健康具有重要現實意義，進而能有效保障我國白酒企業的良性發展及白酒產品的質量安全。

1 白酒中EC形成的代謝機制研究

目前，國外對蒸餾酒中EC 的形成途徑已有較多研究，國內對EC 的研究主要集中于黃酒、葡萄酒。國內外針對我國白酒中EC代謝機制研究較少，主要涉及白酒中EC 及其前體物質檢測方法的開發，酒醅和窖泥中微生物譜系圖的構建，以及分離篩選或利用基因工程手段改造具有生成EC 水解酶的優勢菌株等方面。某些以單一菌株為生產菌株的發酵產品，其EC的形成機制已比較清楚，如黃酒中的EC 主要為酵母或乳酸菌代謝產生的尿素、瓜氨酸和乙醇在煎酒和儲存過程生成。以復雜混菌為發酵主體的發酵過程，如白酒發酵過程中EC 的形成機制尚不清楚。因此，要控制和減少白酒發酵過程中形成的EC，需先闡釋EC 的代謝機制，找尋與EC 形成相關的關鍵物質代謝途徑以及環境調控因素。

1.1 白酒固態發酵過程中EC形成的代謝機制

目前，在白酒固態發酵過程中形成EC 的代謝機制以及其前體物質并不十分清楚。現有研究表明，我國白酒在固態發酵過程中生成EC 途徑可能與發酵酒的發酵過程相類似，梁晨分析了芝麻香型白酒與醬香型白酒在發酵過程中EC 與尿素含量變化情況，發現尿素與EC含量變化顯著相關，而瓜氨酸含量變化與EC 變化不顯著，指出尿素是兩種香型白酒中EC 形成的主要前體物質。除發酵過程中EC前體物質的含量會影響最終EC的含量外，發酵過程中的溫度、pH 值和乙醇的含量都會影響EC 的形成。李擁軍等以濃香型和芝麻香型白酒為例，探究發現酒醅固態發酵過程中EC 積累量遠高于發酵初期，低pH 值酒醅有利于EC 的形成。芝麻香型酒醅EC 主要積累期為發酵2～4 周，占發酵周期EC 形成的83.02 %，濃香型酒醅EC 主要積累于發酵后期。發酵溫度對EC 形成速率影響極大，控制發酵溫度是關鍵因素之一。

此外，瓜氨酸及尿素的形成在很大程度上與發酵微生物有關，釀酒酵母能夠將精氨酸大量轉化成尿素，具有精氨酸脫亞氨基（ADI）途徑的細菌則能代謝精氨酸形成瓜氨酸。瓜氨酸作為非蛋白質氨基酸，通過細菌代謝精氨酸途徑以控制瓜氨酸的積累，進而控制EC生成。針對我國白酒固態發酵過程中EC 前體物質的有效確認是關乎EC 含量控制的重要舉措之一，結合新型科研手段開展白酒固態發酵過程中EC 前體物質的研究成為今后的熱點及重點方向之一。

1.2 我國白酒蒸餾過程中EC 形成的代謝機制

我國白酒在蒸餾過程中溫度可達100 ℃，但EC 的沸點達184 ℃，僅有少量酒醅中EC 經蒸汽流入基酒中，據預測白酒中80%的EC 在蒸餾過程中和蒸餾后48 h 內產生。瓜氨酸因沸點低于尿素，在白酒蒸餾過程中對EC 含量的影響較大。釀酒原料中的生氰糖苷在發酵過程中經β-葡萄糖苷酶水解或者高溫酸解會產生氰醇，在堿性條件或者加熱60 ℃左右會分解產生氰化物，在蒸餾過程中大量無機氰化物生成氰酸鹽，與乙醇反應生成EC。張溫清研究發現白酒蒸餾過程中不同餾分EC 含量相對較低，且面糟發酵層酒醅餾分中EC 含量高于中糟及底糟層，同時，面糟和中糟層餾分中EC 含量呈下降趨勢；張莊英發現白酒在蒸餾前期EC 來源為酒醅中原有的EC，蒸餾后期為前體物質與乙醇反應生成，且氰化物為EC 的主要前體物質。我國白酒生產工藝沿襲古法，應研究如何在保證酒體風味不變的情況下，適宜調整白酒蒸餾過程的操作工藝，以降低白酒中EC的生成。

1.3 我國白酒貯存過程中EC形成的代謝機制

據報道，黃酒和葡萄酒中EC 生成的速度隨著貯存溫度的升高而加快，白酒的貯存溫度亦是影響EC含量的因素之一。由于白酒“越釀越香”，貯存時間長短亦是影響EC 含量多少的原因之一。仇鈺瑩研究發現貯存不同年限的濃香型基酒中EC含量增加與尿素和瓜氨酸含量降低呈相關性變化，通過模擬試驗證實尿素與瓜氨酸為主要前體物質，氰化物對EC 生成作用甚微，這可能與釀酒原料的不同導致引入氰化物含量較低有關，Fang 等亦證實了尿素是基酒貯存期間EC 生產的主要前體物；張莊英研究發現白酒的貯存時間會影響EC 及其可能前體的含量，經線性擬合和雙變量相關分析，氰化物是白酒貯存過程中生成EC的主要前體，瓜氨酸也與此階段EC 的生成有一定關系，但尿素不是白酒貯存過程EC 生成的主要前體，這與前面結論有所不同；王金龍等發現貯存容器、光照和溫度是影響EC 含量的重要因素，陶制容器于低溫避光條件下貯存基酒有利于EC 含量的控制，貯存溫度亦是短期內影響基酒中EC 含量變化較大的原因。結合前人研究結論，發現我國白酒貯存過程中EC 的前體物質主要分為尿素和氰化物兩大類，前期結論的不統一性造成了消除EC 的措施實施困難較大，后期可開展全面解析我國白酒貯存過程中EC來源，為制定合理的控制措施提供思路。

2 白酒中EC控制技術研究

我國白酒中EC 的存在影響消費者身體健康及造成食品安全風險，因此亟需尋找有效降低EC 含量的控制措施。目前研究人員針對EC 的主要來源和形成途徑開發了多種飲料酒中EC 含量的控制措施，包括釀酒原料的選擇，生產工藝控制，發酵菌種的選育及改良或在基酒中直接消除。此外，在白酒中EC含量控制技術研究方面，通過控制合成EC的前體物質的含量，亦可有效減少白酒EC含量。

2.1 酶法降解

酶法降解作為從終端消除EC 的方法，不受前體物質種類限制，對于解決發酵食品中EC所造成的食品安全問題具有重要的研究意義。通過添加EC水解酶（Urethanase）將EC 水解成乙醇、NH和CO。國內外研究者從sp.、sp.、sp.等菌株中分離出EC 水解酶。產EC 水解酶菌株所得酶活力低，且水解EC 的效果因酒種類的不同具有較大差異，故對EC 水解酶的研究仍需加強，加之我國白酒有酸性、乙醇高的特點，對其耐酸性和耐乙醇性提出了更高的要求。因此，仍沒有可有效降解白酒中EC 的水解酶。張素芳等從土壤中篩選得到1 株可高效降解EC 的根瘤土壤桿菌，對EC 的降解率達到95 %，對發酵食品尤其是酒類食品中EC 有很好的降解能力，可有效提升白酒、葡萄酒、清酒、黃酒和米酒等發酵食品的品質安全；陳啟和等利用酒酒球菌可產EC水解酶的能力，降解黃酒在發酵過程中生成的EC，達到有效降解EC 含量的目的；周雪燕等以體積分數5%的戊二醛溶液與殼聚糖交聯8 h 制備的載體對EC 水解酶粗酶液進行固定化，該固定化酶的乙醇耐受范圍廣，催化活性高，EC 去除率達30.90 %，是游離酶的81.53 %，且固定化酶對揮發性風味物質的不利影響遠低于游離酶；劉曉慧研究獲得了滿足工業應用條件的EC 水解酶，通過篩選微生物來源的EC 水解酶，選擇應用特性較好的進行分子改造，提高了耐酸、耐乙醇和底物親和力等方面的應用特性。

酸性脲酶（Urease）作為一種降解尿素以生成CO、水和NH的有效酶，通過降解發酵過程中產生的尿素，間接控制EC含量。當前，有多種產酸性脲酶的菌株被分離篩選，可有效降低尿素含量。方芳等通過將羅伊氏乳桿菌或其粗酶液添加到出窖酒醅中，可降低酒醅中尿素含量，進而減少酒體中EC 含量，達39.1%。脲酶雖已實驗應用于黃酒，葡萄酒和清酒，但因脲酶價格昂貴，故投入到酒企工業化生產的酸性脲酶仍未見報道，將其應用到白酒生產中以控制EC含量且對白酒風味影響較小的脲酶的研究較少。Carreti 等研究人員從發酵乳桿菌）中提取純化酸性脲酶對6款意大利生產的葡萄酒進行了酶法處理并分析EC含量變化，尿素水解成功地降低了EC前體物含量，降低了葡萄酒中的EC 含量；劉慶濤鑒定出來源于ATCC 9945A 的脲酶（BpUrease）為含Fe 的酸性脲酶且能降解EC，通過分子改造的手段強化BpUrease 對黃酒中EC 的降解能力，最終提高BpUrease 在食品級表達系統TEA/pTTB 中的表達量，為BpUrease的工業化應用打下基礎；Jia 等通過SCO2 編碼脲酶基因，在中成功表達脲酶，并優化培養基配方、溫度和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷濃度誘導脲酶的表達，使其表達量提高到14.7 U/mL，SCO2脲酶對黃酒中的EC具有較好的降解能力，其降解率為14.7 %；Masaki 等研究了AmdS 編碼的乙酰胺酶可能有催化降解EC 的能力，經純化的AmdS 被鑒定為由4 個60 kDa單元組成的同型四聚體，具有脲酶活性，AmdS 在0 %～40 %乙醇溶液中穩定、最佳溫度為40 ℃、pH6.4～9.6 時表現出脲酶活性且pH9.6 時活性最高，可作為降解EC 的候選酶類之一；查小紅采用載體固定化和無載體固定化兩種方式對酸性脲酶進行固定化，發現交聯脲酶聚集體（crosslinked urease aggregates，CLUAs）對尿素的去除率較高，達85 %以上，在分批攪拌-膜分離式反應器中，CLUAs 對黃酒中EC 的去除率高達46%，且對產品風味無影響。

目前，已報道篩選出的酶類主要存在對乙醇的耐受性較差、底物特異性及對底物的親和力較差。因此，獲得穩定性好和底物親和力高的高效酶類是實現其白酒工業化應用的重要前提。

2.2 微生物法

釀酒酵母在精氨酸代謝途徑中代謝精氨酸產生尿素，未被分解的尿素會被分泌到胞外，導致尿素的累積。20 世紀90 年代末期科研人員曾篩選出一株精氨酸酶缺陷型酵母菌株，并用于日本清酒發酵模擬試驗，發酵液中無EC 存在。選育低產尿素酵母菌的方法僅適用于純種發酵或以酵母菌為主的發酵過程，我國白酒窖內發酵多為混菌種發酵，對某一菌株的改造無法實現對其中EC 及其前體物質積累的有效控制。江南大學研究人員通過從大曲及酒醅中篩選可降解EC 及其前體物質的內源性菌株，對尿素或EC 具有降解活性，可實現對白酒中EC 及其前體物質的有效減控；Wu 等利用改進的CRISPR/Cas9 系統，在之前修飾過的菌株中表達DUR3 基因，對菌株進行代謝改造，從而進一步降低EC 水平，與N85 原菌株相比，EC 濃度降低了58.5 %，在重復釀造試驗中，該工程菌株在降低尿素含量方面表現出良好的遺傳穩定性。基因操作對酵母菌株的生長和發酵特性的影響較小，因此，構建的菌株在黃酒生產過程中具有降低尿素和EC 含量的潛在應用價值。此外，通過位點飽和誘變提高了urease（Bp Urease）的EC降解能力，實驗表明L253P/L287N菌株能有效降解模型米酒中的尿素和EC，該技術具有良好的食品工業實際應用前景。Guo 等從二倍體葡萄酒酵母WY1 中通過連續缺失兩個CAR1等位基因來阻斷尿素產生途徑，通過構建精氨酸酶缺陷重組菌株YZ22，使EC 含量降低了73.78 %；Cui 等利用MT33 在白酒發酵過程中進行降解EC 及尿素的研究，白酒發酵接種賴氨酸芽孢桿菌，其最大相對豐度從0.02%提高到8.46 %，最終EC 和尿素含量分別降低了41.77 %和28.15 %，EC 在白酒中的濃度降低了63.32 %；Wang 等通過從大曲中分離篩選出釀酒酵母菌株（）并在一系列脅迫條件下進行模擬發酵實驗，在發酵溫度低于25 ℃、pH4.0、乙醇濃度4 %vol～6 %vol 以及一定的初始鹽濃度條件下可通過降低精氨酸酶的轉錄水平和提高尿素羧化酶的轉錄水平以降低精氨酸的消耗和尿素的產生，最終導致EC含量的降低，該措施將有助于改進我國白酒中EC 含量的控制策略。通過基因工程手段改造酵母菌以降低其在窖內發酵過程中產尿素及其他前體物質的能力，對于控制我國白酒中EC 含量和提高其食品安全性具有重要的研究意義。

2.3 優化生產工藝

優化白酒企業生產工藝，同樣可減少白酒中EC含量。我國白酒釀酒原料在發酵過程為EC 的形成提供了重要的前體物質，通過篩選其含量較低的釀酒原料，可以降低發酵過程中EC前體物質含量，進而減少EC的形成。有研究人員發現避光貯存、控制貯存溫度以及縮短貯存時間可有效降低葡萄酒貯存過程中EC的產生；通過酒尾的分離舉措以及使用低溫蒸餾及高回流率等方式亦可實現其中EC 含量。此外，研究發現EC 的合成受pH 值、O、貯存條件等的影響。王霈虹等通過優化黃酒生產工藝中煎酒和滅菌的溫度，達到控制EC 含量的目的；黃庭明采用低溫陳釀方式降低了黃酒中EC 含量。蒸餾過程中使用銅制器皿，因催化劑作用導致其中EC 含量的增加，故通過優化生產工藝，可有效減少EC 含量。我國白酒因獨特生產工藝產生特殊香氣，若采用優化白酒生產工藝的策略，可能很難保證酒體品質。因此，通過優化生產工藝以降低EC 含量能否應用到白酒實際生產過程中仍需全面深入研究考察。

2.4 二次蒸餾法

目前，世界上蒸餾酒多數采用二次或二次以上的液態壺式蒸餾方式，威士忌和甘蔗朗姆酒采用二次蒸餾方式能降低EC 含量。吳晨岑等發現濃香型基酒經壺式、常壓或減壓蒸餾過程后，二次蒸餾方式可有效降低EC 含量，其總酸、總酯濃度降低，感官品質提升，酒體風格依舊；Alcarde等研究了利用二次蒸餾手段降低甘蔗酒中EC 的含量，研究表明，通過二次蒸餾可顯著降低甘蔗酒中EC 含量，在第二次蒸餾過程中，生成的EC 約97 %可從甘蔗酒中除去。二次蒸餾方式消除白酒中EC 含量具有一定的潛在價值，在保證酒體風味的同時考慮設計二次蒸餾設備用于實際生產過程中，可消除我國白酒中EC含量對消費者造成的潛在健康危害。

2.5 NCR調節

在白酒發酵過程中，尿素可被微生物利用分解為NH、CO，氮分解代謝產物抑制（Nitrogen Catabolite Repression，NCR）途徑會影響微生物對尿素的利用，導致其在細胞中積累后釋放到胞外，參與EC 的生成。其中，酵母作為產生尿素的主要菌株，如醬香型白酒的釀酒酵母（）、清香型白酒的異常威克漢遜酵母（）等。通過抑制NCR 正調控因子核定位信號的中磷酸化和負調控因子Ure2p基因的表達，可使優質氮源對酵母中DUR1，2 和DUR3 的表達抑制降至最低，進而減少尿素被釋放到胞外參與生產EC 的可能。Zhao 等通過突變釀酒酵母中核定位信號（Nuclear Location Sequence，NLS）的磷酸化位點并敲除Ure2p基因，使釀酒酵母中DUR1，2 和DUR3 的表達得以激活。研究人員通過調控白酒中釀酒微生物的NCR 環節，增強微生物有效利用尿素的可能，降低胞內尿素釋放至胞外參與EC的生成，進而減少白酒中EC生成。

2.6 直接去除法

除上述降低白酒中EC 含量的措施外，還可以通過利用陰離子交換柱、吸附劑與超聲、微波協同措施以去除EC 及其前體物質，以及添加焦亞硫酸鉀、二乙基二硫代氨基甲酸鈉降低EC 含量等。陳啟和等在黃酒發酵過程中添加沒食子酸（或原兒茶酸，或竹葉提取物），可有效抑制瓜氨酸及尿素轉化生成EC；周凱等在發酵前加入蘆丁和（或）槲皮素與沒食子酸實現同時降低發酵食品中瓜氨酸和EC 累積，EC 降低量最高為64.7 %，并且對產品品質影響較小。此外，亦有研究人員指出，可通過控制施肥，調節原料的營養成分以達到減少EC 的目的。總之，上述方法具有一定減少EC含量的效果，且操作簡單易于工業化應用，但添加外源性物質可能造成產品風味的改變，且抑制效果在應用中并非理想。因此，僅將其作為降低EC 含量的輔助手段。

目前，我國白酒生產過程多采用天然混菌種固體發酵工藝，上述直除方法可應用于單菌種液體發酵體系的發酵及貯存過程和成品酒中EC 含量的控制，不太適用于白酒生產過程中EC含量的控制。

3 白酒中EC污染分布及風險評估

迄今為止，我國白酒香型種類眾多，不同香型白酒中EC 污染存在較大的水平差異。因消費水平的地域差異，造成對飲酒者健康的威脅要高于其他人，故應將白酒中EC 作為風險評估重點。Jung等采用暴露邊界比（Margin of Exposure，MOE）法和致癌風險評估對韓國酒精飲料中EC 含量進行風險評價，依據性別和年齡分組發現韓國飲酒成年人每日飲用酒精飲料為184.2～237.1g/d，在145 種酒精飲料中，韓國燒酒和啤酒對飲酒人群EC 暴露的貢獻值最大，韓國平均飲酒者MOE 和致癌風險值分別為14874 和1.01×10，95 %飲酒者的MOE 和致癌風險分別為2951和5.08×10；張順榮等以10種香型白酒基酒和成品酒中EC 含量為數據來源，占比近一半的成品酒樣品EC含量超過了150μg/L，結合MOE 法對成品酒中EC 風險進行評估發現具有較大的健康風險；彭小東等發現326 份醬香成品酒中有十分之一樣品的EC含量超出了150μg/L，利用MOE法判定其EC的健康風險較小。

白酒作為我國傳統蒸餾酒受到消費者廣泛喜愛，EC 含量的健康風險情況備受關注。我國白酒因生產過程中可能有其他已知或未知的健康風險物質，單純的數據統計不能排除EC 和其他對人體有害物質間交互作用，故僅僅通過MOE 法評估白酒中EC 的健康風險有所不足。鑒于我國白酒中的EC 暴露風險高于國內其他飲料酒類，需要在降低消費的同時發展更嚴格的監管來規范白酒中EC 水平。因此，亟需制定我國白酒中EC的限量標準，采取針對性的控制措施以降低白酒中EC含量。

4 總結與展望

目前，EC 作為白酒固態發酵、蒸餾及貯存過程中產生的主要內源性污染物之一，我國白酒中EC控制措施的研究還相對較少，因此深入研究白酒在發酵、蒸餾及蒸餾后貯存過程中EC 的主要前體物質，主要形成途徑，以及關鍵作用微生物，對于白酒中EC含量的控制有重要意義；開展白酒中EC含量控制的相關措施研究有助于降低生產風險并推動產業化應用，為我國白酒企業食品安全的有序良性發展提供重要的商業價值。因此，我國白酒中EC的相關研究可著重于以下兩個方向：一方面是盡快推進建立我國白酒中EC 含量的限量標準，這可為白酒企業產品食品安全提供指導依據，同時，加快白酒中EC 形成的代謝機制系統性研究，提出切實可行的EC 控制措施應用于實際生產，促進白酒產業的良性可持續發展；另一方面是逐步完善白酒中EC 風險評估方法，通過探究EC 和其他有害物質間的交互作用，實現更加科學可靠的風險評估。