水木和寧方通過調控泛素-蛋白酶體通路對MPP+誘導帕金森病體外模型細胞損傷的影響*

張天琪，李傳成，邱朝陽，劉萍，翟茜茜，霍青

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.臨沂市中心醫院，山東 臨沂 276400；3.濰坊醫學院，山東 濰坊 261000；4.山東省婦幼保健院，山東 濟南 250014；5.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是人類第二大常見的神經退行性疾病，目前全球患病人數已超過600萬，其病理特征包括路易小體和路易神經突起形式的神經包涵體、黑質和其他腦區的細胞丟失[1-3]。泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是體內重要的非溶酶體蛋白降解途徑，功能缺陷時蛋白質不能及時降解，細胞氧化應激水平上升，促使DA神經元變性、凋亡，從而導致PD的發生[4-6]。本病治療以左旋多巴制劑、多巴胺能受體激動劑、抗膽堿能制劑等為主，盡管在一定程度上減輕了癥狀，但仍然無法阻止或逆轉疾病進展，且隨著疾病的進展，藥物的療效會逐漸減弱[7]。長期使用還可能出現“開關現象”、“劑末現象”、肌張力運動障礙等運動并發癥[8]。水木和寧方是霍青經過多年的臨床實踐總結的治療PD的經驗方。本課題組前期多項研究表明，本方可有效改善PD患者運動及非運動癥狀，改善患者睡眠情況，提高患者的生活質量，具有良好的臨床療效[9-11]。課題組前期動物實驗結果表明水木和寧方可能通過調節UPP功能，促進α-syn的降解，從而改善PD小鼠的運動功能[12]。本研究擬在前期工作基礎上，從細胞層面構建PD體外細胞模型，選擇與UPP通路相關的指標，采用Real-time PCR法和Western blotting法進行探究，進一步驗證水木和寧方調控蛋白降解通路，保護多巴胺（dopaminer,DA）能神經元的作用機制。

1 材料

1.1 實驗細胞 PC12細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 水木和寧方配方顆粒（江陰天江藥業有限公司，批號：21051561），由熟地黃10 g，山茱萸6 g，黃精10 g，牛膝10 g，當歸10 g，桃仁10 g，紅花6 g，茯苓10 g，白術10 g，地龍10 g等藥物組成[10]；美多芭（上海羅氏，批號：SH5198），以上藥物均購自山東中醫藥大學附屬醫院。N-甲基-4-苯基吡啶鎓碘化物（MPP+iodide）（美國西格瑪公司，批號：D048）；MTT試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：M8180）；胎牛血清（Lonsera，批號：OB08933）；RPMI 1640培養基（美國康寧公司，批號：BIO10040CV）；BCA試劑盒（批號：P0012S）、ECL化學發光液（批號：P0018S）、SDS-PAGE試劑盒（批號：P0690）均購自上海碧云天技術有限公司；TH抗體（批號：ab112）、UCH-L1抗體（批號：ab8189）、ubiquitin抗體（批號：ab7780）、Parkin抗體（批號：ab77924）、α-syn抗體（批號：ab52168）、UBE1抗體（批號：ab181225）均購自Abcam公司；beta-actin抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：20536-1-AP）；HRP標記山羊抗兔IgG二抗（批號：7074）、HRP標記山羊抗鼠IgG二抗（批號：7076）均購自CST公司；RNA快速提取試劑盒（思科捷生物，批號：AC0202）；反轉錄試劑預混液試劑盒（批號：AG11706）、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒（批號：AG11701）、PCR引物均購自艾科瑞生物。

1.3 主要儀器 Multiskan Go1510型酶標儀、NanoDrop2000型微量紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技公司）；Light Cycler 480 Ⅱ型實時熒光定量PCR儀（美國羅氏集團）；Mini-Protean Tetra電泳系統、轉膜儀（美國伯樂公司）；Fluor Chem Q成像和分析系統（美國Protein simple公司）；Axiovert 40型倒置相差顯微鏡（德國卡爾蔡司）。

2 方法

2.1 水木和寧方的配制 在傳統煎煮方法的基礎上，參考現代離體實驗中藥提取方法[13]。計算水木和寧方顆粒各味中藥總和為300 g，將中藥溶解于180 mL高壓滅菌的ddH2O中，使用水浴鍋進行加熱，最終配制成質量濃度為2 g/mL的中藥母液。將中藥母液分裝后，以5 000 r/min離心10 min，經過多次離心后，取上清液，0.22 μm濾膜進行過濾除菌，分裝避光儲存于-80 ℃冰箱中，現取現用。

2.2 細胞培養 細胞復蘇后，培養于RPMI 1640培養液中（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素），37 ℃、5% CO2飽和濕度下進行培養，隔日更換1次培養液，待細胞生長融合至80%以上時，消化傳代，選用對數生長期細胞進行后續實驗。

2.3 PD體外細胞模型建立 MPP+不僅能夠損害DA能神經元，產生PD樣癥狀，還能在體外實驗中誘導α-syn的過表達和聚集，因此本實驗選用MPP+誘導PD模型[14-15]。實驗設6個復孔，每孔100 μL，設置空白對照組、對照組、實驗組（MPP+）。實驗組分為0.25、0.5、1、2 mmol/L共4個濃度，空白對照組和對照組棄原液，加入1640基礎培養基，采用MTT法篩選MPP+的最佳濃度。選用MPP+最佳濃度作用于細胞，孵育24 h，觀察造模情況。

2.4 水木和寧方和美多芭藥物最佳濃度篩選 篩選水木和寧方最佳濃度時，分為空白對照組、對照組、實驗組（水木和寧方）。實驗組分為0.5、1、2、4、6、8、10、12 mg/mL共8個質量濃度，空白對照組和對照組棄原液，加入1640基礎培養基，采用MTT法篩選最佳濃度。美多芭藥物最佳濃度的篩選方法同水木和寧方，藥物質量濃度分別設置為25、12.5、6.25、3.125 l、1.5625μg/mL。

2.5 細胞分組及處理 實驗分為對照組、模型組、水木和寧方組、美多芭組，干預一定時間后，收取細胞上清，凍存于-80 ℃冰箱，以備后續進行Real-time PCR和Western blotting檢測。

2.6 水木和寧方對MPP+誘導的PC12細胞形態學影響 細胞干預結束后，將細胞培養瓶放置于倒置顯微鏡下觀察，詳細記錄各組細胞形態學改變，并拍照分析。

2.7 水木和寧方對MPP+誘導的PC12細胞存活率的影響 采用MTT法檢測細胞存活率，將細胞稀釋成濃度為1×105個／mL的懸液，每孔取100 μL接種于96孔培養板中。培養24 h后，根據實驗分組的不同進行干預，每孔設置6個復孔，藥物干預24 h后加入200 μL MTT溶液（5 mg/mL）。繼續培養4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，酶標儀490 nm處測定吸光度值，并計算細胞存活率。

2.8 Real-time PCR法檢測泛素化相關分子mRNA表達水平 根據試劑盒說明提取總RNA，測定RNA濃度。通過反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內參，使用PCR儀進行擴增和檢測。PCR擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，共40個循環；溶解曲線95 ℃5 s，65 ℃60 s；降溫50 ℃30 s。每個實驗指標重復檢測3次取其平均值，計算采用2-ΔΔCt法進行分析。引物序列見表1。

表1 α-syn、TH、泛素化相關基因引物序列

2.9 Western blotting法檢測泛素化相關蛋白的表達 采用RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清收集總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃一抗（β-actin 1∶5 000，Ubiquitin 1∶1 000，α-syn 1∶500，UCH-L1 1∶400，Parkin 1∶400，TH 1∶400，E1 1∶1 000）孵育過夜。次日TBST洗膜15 min×3次，加入二抗（羊抗兔1∶5 000，羊抗小鼠1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜15 min×3次。最后通過化學發光劑ECL顯色曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.10 統計學方法 采用IBM SPSS 26.0進行統計學處理，計量資料以“均數±標準差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 MPP+最佳造模濃度篩選 隨著MPP+濃度的升高，OD值逐漸下降，MPP+濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L時，OD值分別為1.233±0.012、1.116±0.008、0.867±0.018、0.660±0.011、0.403±0.014，細胞存活率依次為為100.00%、92.46%、70.29%、53.53%、37.71%，差異有統計學意義（P＜0.05）。當1 mmol/L MPP+作用于PC12細胞時，細胞存活率為53.53%，接近于IC50值，對細胞的影響差異有統計學意義（P＜0.05），故本實驗選擇1 mmol/L作為MPP+最佳造模濃度。（見圖1）

圖1 MPP+對PC12 細胞存活率的影響（，n=3）

3.2 水木和寧方和美多芭藥物最佳濃度選擇 隨著水木和寧方濃度的升高，PC12細胞的活力呈下降趨勢，當水木和寧方質量濃度大于6 mg/mL時，細胞存活率明顯降低（P＜0.05），故選擇6 mg/mL作為水木和寧方最佳干預濃度。隨著美多芭濃度的升高，細胞存活率呈下降趨勢，當美多芭質量濃度大于3.125 μg/mL，細胞存活率明顯降低（P＜0.05），因此本實驗選擇3.125 μg/mL作為美多芭最佳干預濃度。（見圖2）

圖2 水木和寧方和美多芭對PC12 細胞存活率的影響（，n=3）

3.3 各組PC12細胞存活率比較 與對照組比較，模型組PC12細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，水木和寧方組和美多芭組PC12細胞存活率明顯升高（P＜0.05），且水木和寧方組PC12細胞存活率明顯高于美多芭組（P＜0.05），進一步說明水木和寧方和美多芭對MPP+誘導的PC12細胞具有保護作用，能夠提高PC12細胞存活率，且水木和寧方對細胞保護作用優于美多芭。（見圖3）

圖3 各組PC12 細胞存活率比較（，n=3）

3.4 各組PC12細胞形態學比較 對照組PC12細胞呈長梭形或者多角形貼壁生長，折光性能良好，有類似神經細胞的突起；模型組PC12細胞呈圓形，折光性變差，間隙變大，懸浮細胞數目增多，突觸數目減少；水木和寧方組和美多芭組PC12細胞的形態、折光性、細胞間隙、突觸數目均優于模型組，由此可見水木和寧方和美多芭對MPP+誘導的PC12細胞的損傷具有一定保護作用。（見圖4）

圖4 各組PC12 細胞形態學比較（×10）

3.5 各組PC12細胞α-syn、TH、泛素化相關分子mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組PC12細胞α-syn mRNA表達明顯上調（P＜0.05），TH mRNA、UBE1 mRNA、Parkin mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表達均明顯下調（P＜0.05）；與模型組比較，水木和寧方組和美多芭組PC12細胞α-syn mRNA表達均明顯下調（P＜0.05），TH mRNA、UBE1 mRNA、Parkin mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表達均明顯上調（P＜0.05）；與美多芭組比較，水木和寧方組PC12細胞α-syn mRNA表達均明顯下調（P＜0.05），TH mRNA、UCH-L1 mRNA、ubiquitin mRNA表達均明顯上調（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組PC12 細胞α-syn、TH、泛素化相關分子mRNA表達水平比較（，n=3）

表2 各組PC12 細胞α-syn、TH、泛素化相關分子mRNA表達水平比較（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與美多芭組比較，cP＜0.05

3.6 各組PC12細胞α-syn、TH、泛素化相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組PC12細胞α-syn蛋白表達明顯上調（P＜0.05），TH、UBE1、Parkin、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達均明顯下調（P＜0.05）；與模型組比較，水木和寧方組和美多芭組PC12細胞α-syn蛋白表達均明顯下調（P＜0.05），TH、UBE1、Parkin、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達均明顯上調（P＜0.05）；與美多芭組比較，水木和寧方組PC12細胞α-syn蛋白明顯下調（P＜0.05），TH、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達均明顯上調（P＜0.05）。（見圖5、表3）

圖5 各組PC12 細胞α-syn、TH、泛素化相關蛋白表達Westem blotting圖

表3 各組PC12 細胞α-syn、TH、泛素化相關蛋白表達比較（，n=3）

表3 各組PC12 細胞α-syn、TH、泛素化相關蛋白表達比較（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與美多芭組比較，cP＜0.05

4 討論

UPP是體內重要的蛋白質降解途徑，是保護細胞免受錯誤折疊蛋白質毒性作用的重要的機制之一，多項研究結果表明UPP與神經退行性疾病密切相關[16]。UPP通過泛素、泛素相關酶、蛋白酶體等調控特定蛋白的降解，調節細胞周期、免疫及炎癥反應、細胞凋亡等[17]。氧化應激、內質網應激、細胞老化可導致蛋白錯誤折疊，導致損害蛋白的積聚。當損害蛋白異常聚集超過了UPP的降解能力時，可導致泛素化損害蛋白的積聚，進而影響神經元功能障礙甚至死亡[18-19]。越來越多的遺傳、病理和實驗證據表明，家族性和散發性帕金森病的神經變性可能與UPP清除蛋白質缺陷有關，導致蛋白質積累、聚集和細胞毒性[20]。

UPP在PD的發生發展過程中扮演著重要的角色，尤其是清除Lewy小體內積聚的α-syn、Parkin蛋白等。研究發現α-syn、Parkin和UCH-L1是3種與UPP功能障礙密切相關的突變基因[21]。其中α-syn是UPP主要底物蛋白，大量聚集會導致線粒體損傷誘發細胞凋亡[22]。在氧化應激、環境毒性損害或老化等外部因素作用下，α-syn的異常積聚通過刺激免疫反應、影響自噬、破壞DA的存儲與釋放等，最終導致DA能神經元細胞凋亡。UCH-L1具有泛素水解酶、連接酶活性，能維持泛素單體穩定，對神經元具有抗氧化保護作用。研究發現，UCH-L1與α-syn共聚集，其家族突變與帕金森病和其他神經退行性疾病相關[23]。UCH-L1的某些翻譯后修飾可能促進細胞質的UCH-L1（C）轉變為膜相關的UCH-L1（M）形式，在α-突觸核蛋白病的形成中發揮了作用[24]。Parkin作為E3泛素連接酶，能參與細胞周期調控、線粒體動態平衡和能量代謝，調節泛素化過程及細胞自噬，在蛋白質分解代謝中發揮著重要作用，這些或許都作為Parkin預防PD的基礎[25]。研究表明，TH是催化生物體自身合成左旋多巴胺系列反應中第一步反應的限速酶，在DA合成中發揮重要作用，其含量變化與PD的發生、發展有著重要聯系[26]。

本研究從細胞層面驗證水木和寧方通過調節UPP功能對PD的影響，并采用MPP+誘導PD體外細胞模型。本研究發現造模后UPP功能異常，TH、UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白和mRNA表達明顯降低，α-Syn蛋白和mRNA表達明顯升高，考慮可能是MPP+抑制了UPP中蛋白酶體的功能，抑制了蛋白降解通路。水木和寧方干預后，TH、UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白表達明顯升高，α-Syn蛋白表達明顯降低，提示水木和寧方可促進蛋白質降解，改善UPP功能。與美多芭組比較，水木和寧方組α-syn蛋白明顯降低，TH、UCH-L1、ubiquitin蛋白表達明顯升高。本實驗結果與本課題組前期動物實驗結果一致，由此可見水木和寧方可以通過調控UPP功能，抑制α-Syn蛋白的聚集，從而促進蛋白質的降解，具有良好的保護DA能神經元的作用。

水木和寧方由生地黃、肉蓯蓉、狗脊、麥冬等31味藥物組成[10]。研究表明生地黃主要是通過豆甾醇作用于MAOA、ADRA1B、ADRA1A等靶點，從多個途徑發揮治療帕金森病的作用[27]。現代藥理研究也表明方中多種成分，如肉蓯蓉多糖、遠志皂苷、牛膝多肽等可以抑制神經元凋亡，抗氧化應激損傷，具有保護多巴胺能神經元的作用[28-31]。鑒于帕金森病發病時間長，“久病入絡，久病及腎”及結合自身臨床經驗，霍青提出了帕金森病以“肝腎虧虛為本，痰濁瘀血為發病之標”的發病機制，并制定了滋補肝腎、活血通絡、祛瘀化痰的治療方法，同時應治標與治本相結合，靈活應用，充分發揮中醫藥多靶點、整體調節優勢。本研究在前期動物實驗的基礎上，從細胞層面證實水木和寧方能通過提高UPP活性，清除異常蛋白，促進蛋白質降解，從而減輕DA能神經元細胞損傷，為水木和寧方治療PD提供了理論依據和實驗支持，也為PD中西醫結合治療提供了新思路。