香菇多糖通過調控miR-221表達對肺結核大鼠巨噬細胞凋亡的影響*

沈凌筠，李莉，王戈，曾海燕，駱鵬舉，朱興玉

（1.云南省傳染性疾病臨床醫學中心/昆明市第三人民醫院，云南 昆明 650000；2.昆明醫科大學基礎醫學院，云南 昆明 650000）

結核分枝桿菌作為一種寄生菌，在機體中不能單獨存活，需寄生在細胞內，當侵染肺臟時，可造成患者胸悶氣短、喘息咳嗽、低熱盜汗、消瘦乏力等癥狀，胸片上可見結核空洞或斑片狀陰影，極大影響患者正常工作、生活[1-3]。結核分枝桿菌進入肺臟，寄生在巨噬細胞中，可導致其凋亡，釋放出寄居的結核桿菌，增強肺部感染。結核分枝桿菌還能激活周圍未被寄生的巨噬細胞，促進氧自由基及多種炎癥因子產生，引發肺組織炎癥與過氧化損傷，使巨噬細胞凋亡進一步增強，加重肺損傷，因而降低巨噬細胞凋亡對肺結核的防治至關重要[4-5]。香菇多糖是自香菇子實體中分離出的一種葡聚糖，具有明顯的抗真菌、抗細菌、抗病毒等作用，能明顯抑制脂多糖刺激的NLRP3炎性信號激活，下調凋亡蛋白表達，抑制腸上皮細胞凋亡，緩解腸道損傷，還可顯著降低非小細胞肺癌合并肺結核患者血清炎癥因子水平，增強其機體免疫力，提高療效[6-7]。由此可推測，香菇多糖可能抑制肺結核大鼠巨噬細胞的凋亡。miR-221是診斷結核病的一種生物標志物，參與介導肺結核、急性肺損傷等肺部疾病的發病過程，降低miR-221的表達，可顯著減輕脂多糖誘導的肺部炎癥，抑制肺細胞凋亡，改善肺組織損傷[8-9]。因此，miR-221可作為緩解肺結核大鼠巨噬細胞凋亡的潛在作用靶點。本研究以尾靜脈注射結核分枝桿菌懸液的方法建立肺結核大鼠模型，探討香菇多糖通過調控miR-221表達對肺結核大鼠巨噬細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雄性SD大鼠72只，體質量190～210 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號：SCXK（魯）2019-0003，在通風良好的動物房中飼養，溫度設為25 ℃、濕度設為54%，照明以12 h/12 h明暗交替循環，大鼠自由飲水進食。本實驗經本院動物倫理委員會批準，在實驗過程中嚴格遵循3R原則。

1.2 藥物與試劑 結核分枝桿菌H37Rv（批號：19080311）購自中國藥品與生物制品鑒定所；分枝桿菌即用型液體培養基（批號：GOMY0019）購自上海晶諾生物科技有限公司；香菇多糖（HPLC≥98%，批號：XY24117）購自上海信裕生物科技有限公司；含瓊脂斜面培養基（批號：SY0498）購自北京伊塔生物科技有限公司；DMEM（含雙抗）培養基（批號：12100）、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）檢測試劑盒（批號：CA1410）、ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（批號：CA1020）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒（批號：BC0025）、總RNA提取試劑盒（批號：R1200）、HE染色試劑盒（批號：G1120）、一步法實時熒光定量試劑盒（批號：T2210）、高效RIPA裂解液（批號：R0010）、大鼠白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）檢測試劑盒（批號：SEKR-0007）、大鼠白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）檢測試劑盒（批號：SEKR-0005）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源Anti-Caspase-9一抗（批號：ab185719）、兔源Anti-GAPDH一抗（批號：ab181602）、兔源Anti-Bax一抗（批號：ab32503）、羊抗兔二抗（批號：ab150077）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 ZX-400型全自動菌落計數儀（杭州澤析生物科技有限公司）；XElx800型酶標儀（珀金埃爾默企業管理有限公司）；ASP300S型全封閉式組織脫水機、RM2035型輪轉切片機、EG1160型包埋機、DCM8型光學顯微鏡均購自德國Leica公司；ZE5型流式細胞儀、1659001型蛋白電泳儀、CFX96型實時熒光定量PCR儀、Trans-Blot Turbo型蛋白轉印系統、ChemiDoc XRS型凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.4 造模與分組 參照文獻[10]制備肺結核模型大鼠，將購買的結核分枝桿菌置于0.9%NaCl溶液中，制備細菌懸液，接種在液體培養基中，于37.5 ℃條件下培養5周，離心得到細菌沉淀，以0.9%NaCl溶液制備成質量濃度5 mg/mL的懸液，尾靜脈注射0.2 mL構建肺結核模型大鼠。病理組織切片觀察肺部組織有明顯的干酪樣壞死、液化灶等病變提示造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、miR-221 agomir陰性對照組、miR-221 agomir組、香菇多糖組、香菇多糖+miR-221 agomir組，每組12只，另選12只SD大鼠作為對照組，尾靜脈注射0.9%NaCl溶液0.2 mL。

1.5 實驗給藥 香菇多糖溶于0.9%NaCl溶液，配制為5 mg/mL的香菇多糖[11]藥液，香菇多糖+miR-221 agomir組大鼠參照miR-221 agomir說明書及文獻[9]尾靜脈注射2 mg/kg的miR-221 agomir（2次/周），同時灌胃10 mL/kg的香菇多糖藥液（1次/d）；香菇多糖組大鼠灌胃10 mL/kg的香菇多糖藥液（1次/d），同時尾靜脈注射（與miR-221 agomir組相同的方法）等量0.9%NaCl溶液（2次/周）；miR-221 agomir組、miR-221 agomir陰性對照組大鼠分別尾靜脈注射miR-221 agomir、miR-221 agomir陰性對照，2 mg/kg，2次/周，同時灌胃10 mL/kg的0.9%NaCl溶液（1次/d）；對照組、模型組大鼠灌胃10 mL/kg的0.9%NaCl溶液（1次/d），同時尾靜脈注射（與miR-221 agomir組相同的方法）等量0.9%NaCl溶液（2次/周）。各組大鼠均給藥干預2周。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠結核分枝桿菌菌落計數及收集標本 各組大鼠于給藥結束后24h，以乙醚氣體進行麻醉，從腹主動脈吸出血液1.5mL，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，吸出上清，保存在-80 ℃冰箱。各組隨機選出6只大鼠斷頭處死，開腹取出雙肺，以蒸餾水漂洗左肺，進行脫水、透明、包埋、切片后，得到厚約4 μm的肺組織薄片備用；剪下右肺組織1.2 g（分為0.4 g和0.8 g的兩塊），保存在液氮中；再次剪下右肺組織1.0 g，加入適量0.9%NaCl溶液后以硫酸消化，接種在斜面培養基中，37.5 ℃條件下培養5周，采用全自動菌落計數儀計數培養基上菌落數。

1.6.2 大鼠肺泡巨噬細胞凋亡檢測 收集支氣管肺泡巨噬細胞：選1只未做處理的大鼠，以乙醚麻醉后切開氣管，采用注射器吸取5 mL 0.9%NaCl溶液注入肺組織，收集肺泡灌洗液，重復3次，得到的灌洗液于4 ℃下800 r/min離心15 min，以PBS緩沖液洗滌細胞沉淀3次后，加入適量DMEM培養基重懸細胞，通過臺盼藍染色檢測細胞存活情況，活細胞＞90%，表明大鼠肺泡巨噬細胞收集成功。

肺泡巨噬細胞凋亡檢測：按照上述方法收集各組剩余的6只大鼠肺泡巨噬細胞，得到細胞沉淀后，以PBS緩沖液重懸，參照試劑盒說明指導步驟，加入適量ArmexinV-FITC與PI，避光孵育10min，上樣到流式細胞儀中，檢測肺泡巨噬細胞凋亡情況。

1.6.3 大鼠肺組織病理變化檢測 取出“1.6.1”中的肺組織切片，做脫蠟、水化處理后，參照試劑盒說明指導步驟，進行HE染色，以“1.6.1”中方法再次脫水、透明后封片，在光學顯微鏡下觀察著色情況，評測各組大鼠肺組織病理形態，任意選出5個視野，收集其圖像。

1.6.4 大鼠肺組織ROS、MDA水平與血清IL-6、IL-17水平 取“1.6.1”中凍存在液氮中的0.8 g肺組織，剪為小碎塊后置于適量高效RIPA裂解液中，勻漿后4 ℃下3 000 r/min離心25 min，吸出上清，取出0.12 mL，使用試劑盒參照其說明指導步驟，測量其中ROS、MDA水平。

取“1.6.1”中凍存在-80 ℃的血清提前以冰水浴解凍，使用試劑盒參照其說明指導步驟，測量其中IL-6、IL-17水平。

1.6.5 qRT-PCR法測定各組大鼠肺組織miR-221表達水平 取“1.6.1”中凍存在液氮中的0.8 g肺組織，剪為小碎塊后，以試劑盒參照其說明指導步驟，提取總RNA后進行實時熒光定量PCR反應，以U6作為miR-221的內參基因，所得Ct值通過2-ΔΔCt算法進行分析，得到miR-221的相對表達量。miR-221、U6基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.6.6 免疫印記法檢測各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平 取“1.6.4”中剩余的肺組織蛋白樣品液，使用試劑盒通過BCA法，參照其說明指導步驟測出蛋白濃度后調至各組相同，電泳（120 V，75 min）分離蛋白，濕轉（40 mA，60 min）轉移蛋白至硝酸纖維膜上，將膜置于5%脫脂奶粉溶液中封閉（37 ℃，2 h），剪下目的蛋白條帶，分別以兔源Anti-Caspase-9一抗、兔源Anti-GAPDH一抗、兔源Anti-Bax一抗孵育（4 ℃，11 h），TBST漂洗3次（5 min/次）后，使用羊抗兔二抗孵育（37 ℃，1.5 h），TBST漂洗3次（5 min/次）后，通過增強化學發光法對蛋白條帶顯色，采用凝膠成像儀拍照后以Image Lab軟件定量其灰度值，經統計分析后得出各組蛋白相對表達。

1.7 統計學方法 運用SPSS 24.0軟件進行統計分析，計量資料以“均數±標準差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數比較 與對照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數比較（）

表2 各組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠肺組織病理形態改變情況 對照組大鼠肺組織結構形態無病理變化；模型組、miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織結構形態破壞嚴重，出現大量結核結節，肺間質水腫且炎癥細胞浸潤明顯，肺泡結構變形，可見壞死細胞脫落；與模型組、miR-221 agomir陰性對照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織上述病理損傷均明顯減輕，miR-221 agomir組大鼠肺組織上述病理損傷均明顯加重；與模型組比較，miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織上述病理損傷無明顯改變。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE，×200）

2.3 各組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡情況比較 與對照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖2、表3）

表3 各組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率比較（）

表3 各組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

圖2 各組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡情況

2.4 各組大鼠肺組織過氧化水平比較 與對照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織ROS、MDA水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織ROS、MDA水平明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺組織ROS、MDA水平明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織ROS、MDA水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠肺組織ROS、MDA 水平比較（）

表4 各組大鼠肺組織ROS、MDA 水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

2.5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17水平比較 與對照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對照組大鼠血清IL-6、IL-17水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠血清IL-6、IL-17水平明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠血清IL-6、IL-17水平明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對照組大鼠血清IL-6、IL-17水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17 水平比較（，pg/mL）

表5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17 水平比較（，pg/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

2.6 各組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組、miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組、miR-221 agomir陰性對照組、香菇多糖+miR-221 agomir組比較，香菇多糖組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平明顯降低（P＜0.05），miR-221 agomir組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平明顯升高（P＜0.05）；miR-221 agomir陰性對照組大鼠肺組織miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖3、表6～7）

圖3 各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表達Western blotting圖

表6 各組大鼠肺組織miR-221 表達水平比較（）

表6 各組大鼠肺組織miR-221 表達水平比較（）

表7 各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表達水平比較（）

表7 各組大鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表達水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與香菇多糖+miR-221 agomir組比較，cP＜0.05

3 討論

相比其他眾多感染性疾病，結核病的致死率更高。近年來，我國肺結核發病率有所上升，已成為死亡率最高的傳染性疾病之一，是亟需解決的重要公共衛生問題[12-13]。在肺結核的發生及病情進展過程中，巨噬細胞發揮著關鍵作用，巨噬細胞可識別結核分枝桿菌，激活機體免疫，進而對其進行殺滅。寄生感染肺部巨噬細胞時，可極大促使巨噬細胞凋亡，不僅釋放出大量結核分枝桿菌，造成擴散感染，還可進一步激活巨噬細胞，促進炎癥與過氧化反應發生發展，加重肺組織病理損傷，因而抑制巨噬細胞凋亡，對于結核分枝桿菌的清除及肺結核的防治意義重大[4-5,14-15]。本研究通過尾靜脈注射結核分枝桿菌懸液誘導建立肺結核大鼠模型，結果顯示，大鼠在注射后，其肺組織結構形態遭到嚴重破壞，出現大量結核結節，肺間質水腫且炎癥細胞浸潤明顯，肺泡結構變形，可見壞死細胞脫落。肺組織中結核分枝桿菌菌落數、巨噬細胞凋亡率、肺組織ROS與MDA水平、血清炎癥因子IL-6與IL-17水平、肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平均明顯升高，表明結核分枝桿菌可在肺臟中大量增殖擴散，促使肺組織中巨噬細胞凋亡，誘導ROS和促炎因子過量釋放表達，引發強烈的炎癥與過氧化反應，造成嚴重的肺組織損傷。

香菇多糖是一種具有明顯抗菌消炎作用的天然產物，可通過下調NLRP3蛋白表達抑制脂多糖引發的腸組織細胞凋亡，保護腸道功能，減少小細胞肺癌合并肺結核患者炎癥因子表達，改善其臨床癥狀，還可降低弓形蟲感染引發的氧化應激水平，減輕嚴重的炎癥反應，增強巨噬細胞增殖和吞噬能力，提升其免疫力，控制感染性疾病進展[6-7,16-17]。本研究以香菇多糖處理肺結核模型大鼠，可明顯減輕其肺組織病理損傷，降低結核分枝桿菌菌落數、巨噬細胞凋亡率、肺組織ROS與MDA水平、血清炎癥因子IL-6與IL-17水平、肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平，表明香菇多糖可抑制結核分枝桿菌在肺組織中的增殖，減輕巨噬細胞凋亡，減弱結核分枝桿菌感染引發的炎癥及氧化應激反應，緩解肺損傷，證實了香菇多糖可抑制巨噬細胞凋亡，發揮抗結核功能。

miR-221是抑制調控炎癥的微小RNA，在肺結核、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、呼吸道感染等肺臟疾病的發生及進展過程中起到重要調控作用。下調其表達，可降低炎癥細胞因子表達，控制炎癥發生發展，減輕脂多糖誘導的肺組織損傷，并抑制支氣管上皮細胞凋亡，改善哮喘癥狀，緩解肺炎支原體引起的肺部感染[8,18-20]，因而，miR-221是防治肺結核的重要作用靶點。本研究結果顯示，miR-221在肺結核模型大鼠肺組織中過表達，以miR-221 agomir上調其表達，可加重大鼠肺組織損傷，升高結核分枝桿菌菌落數、巨噬細胞凋亡率、肺組織ROS與MDA水平、血清炎癥因子IL-6與IL-17水平、肺組織凋亡蛋白Caspase-9、Bax表達水平，表明miR-221能介導肺結核大鼠發病過程，促使其病情進展及巨噬細胞凋亡。miR-221 agomir可幾乎完全抵消香菇多糖的抗巨噬細胞凋亡作用，并逆轉其抗結核作用，表明香菇多糖能通過下調miR-221表達來減輕結核分枝桿菌感染引發的肺組織嚴重及過氧化損傷，并抑制巨噬細胞凋亡。

綜上所述，香菇多糖可減少ROS與致炎細胞因子釋放，抑制結核分枝桿菌感染引發的炎癥及過氧化反應，減弱巨噬細胞凋亡，發揮抗結核病功效，且下調miR-221表達是其分子機制之一。本研究為香菇多糖的抗結核臨床應用提供了實驗依據，為結核病患者帶來了更多的治療策略。