響應面法優化肉桂精油微膠囊的制備工藝研究*

鄒惠亮，陳柯，陳褚建，王新財，成霄，張誠賢，陳敏

（湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000）

肉桂來源于樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮[1]，其提取物肉桂精油有著悠久且廣泛的使用歷史。肉桂精油的主要成分為肉桂醛和丁香酚等物質[2]。肉桂精油具有良好的抗氧化、抗菌活性[3-4]，在食品、藥品及化妝品等領域都具有良好的開發前景[5]。但肉桂精油容易揮發及降解，其主要活性成分在空氣中易氧化變質而導致功效降低[6-7]，使其應用受到限制。

將植物精油微膠囊化，能有效防止其氧化和降解，并且能夠控制植物精油緩慢釋放[8]。近年來，隨著微膠囊技術的日益成熟，植物精油微膠囊在眾多領域得到了廣泛應用[9]。目前常用的微膠囊制備方法有噴霧干燥法、復凝聚法、超臨界流體法等，其中復凝聚法具有操作簡單、設備要求低、穩定性高等特點，是一種良好的微膠囊制備方法。至今已有松籽油、廣藿香油、茶油和野壩子揮發油等通過復凝聚法被成功制備成微膠囊的研究報道[10-13]，但目前關于應用復凝聚法制備肉桂精油微膠囊并對其進行結構表征與性能研究的報道較少。

本研究以明膠與阿拉伯膠為壁材，肉桂精油為芯材，采用復凝聚法制備肉桂精油微膠囊，并以包埋率為主要指標對制備工藝進行優化，同時對微膠囊進行顯微、紅外光譜的結構表征和緩釋性能的測定，以期為肉桂精油的開發利用提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 數顯電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；76-1A型電動攪拌玻璃恒溫水浴（常州國宇儀器制造有限公司）；UV2600型紫外分光儀（日本島津公司）；Hicolet型紅外分光光度計（美國熱電公司）；T18型高速勻漿機（德國IKA公司）；DM2500型生物顯微鏡（Leica公司）；XS205DU型十萬分之一電子分析天平（Mettler Toledo公司）；Mili-Q超純水系統（Millipore公司）。

1.2 藥物與試劑 肉桂精油（批號：BH14865，上海博湖生物科技有限公司）；明膠（批號：C11527215，上海麥克林生化科技有限公司，含有量99%，生物技術級）；阿拉伯膠（批號：C12115131，上海麥克林生化科技有限公司，醫藥級）；吐溫-80（批號：C11717332，上海麥克林生化科技有限公司）；谷氨酰胺轉氨酶（批號：Q15N11N130754，上海源葉生物科技有限公司）；冰乙酸（批號：20210129，國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（批號：20130530，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 肉桂精油微膠囊制備 參照梁博等[12]的實驗方法，并稍作修改。稱取阿拉伯膠和明膠各2 g分別溶于100 mL蒸餾水中，備用。按比例稱取一定量的肉桂精油與明膠溶液混合，同時加入2 mL吐溫-80，6 000 r/min剪切乳化2 min，在一定溫度的水浴中200 r/min的機械攪拌下，向肉桂精油混合乳液中逐滴加入阿拉伯膠溶液，攪拌均勻，隨后滴加10%醋酸溶液，調節混合液pH值至預定值，同時在顯微鏡下觀察至微囊形成，繼續反應一定時間。從水浴取出燒杯，攪拌降溫，隨后移至冰浴中，急速降溫至10 ℃以下，用10%的NaOH溶液調節pH值至6.0，加入谷氨酰胺轉氨酶（固化劑）1 g，保持15 ℃攪拌固化3 h。室溫下靜置12 h，經離心、洗滌后，得到濕微膠囊，低溫干燥，即得肉桂精油微膠囊。

2.2 肉桂精油線性關系考察 對肉桂精油進行全波段掃描后將紫外檢測波長定為286 nm。將肉桂精油用無水乙醇稀釋到不同濃度梯度，以無水乙醇作為空白對照，于286 nm波長下測定吸光度，以吸光度與樣品濃度建立線性回歸方程。并以肉桂精油濃度（μg/mL）為橫坐標（X軸），吸光度為縱坐標（Y軸），繪制標準曲線，得回歸方程Y=209.4X-0.009 7（R2=0.999 4），線性范圍為2.0～10.0 μg/mL。

2.3 微膠囊包埋率測定 稱取0.05 g微膠囊，加入一定量的無水乙醇，超聲提取15 min，使其完全破壁溶解。過濾，將濾液稀釋至合適的體積，在286 nm測定其吸光度，并根據標準曲線計算微膠囊中肉桂精油量[14]，然后計算微膠囊的包埋率。包埋率（%）=（微膠囊中肉桂精油的量/加入肉桂精油總量）×100%。

2.4 單因素試驗 以包埋率為主要評價指標，選取壁芯比、復凝聚pH值、成囊溫度、反應時間4個因素作為單因素考察的對象。

2.4.1 壁芯比對包埋率的影響 設定復凝聚pH值為3.5、成囊溫度為40 ℃、反應時間為30 min，在不同壁芯比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1）條件下按“2.1”項下方法制備微膠囊，并測定包埋率，結果見圖1。在壁芯比1∶2～2∶1范圍內，壁材濃度的增加可以提高微膠囊的包埋率；壁芯比大于2∶1時，包埋率反而降低。可能壁材濃度過低時不足以用來包埋體系中的肉桂精油，因此包埋率較低，隨著壁材濃度不斷增加包埋率也逐漸升高。但當壁材過多時，壁材會凝聚結塊，影響微膠囊形成，浪費壁材。

圖1 壁芯比對微膠囊包埋率的影響

2.4.2 成囊溫度對包埋率的影響 設定復凝聚pH值為3.5、壁芯比為2∶1、反應時間30 min，在不同的成囊溫度（25、35、45、55、65 ℃）下按“2.1”項下方法制備微膠囊，并測定包埋率，結果見圖2。隨著成囊溫度的升高，包埋率先升高后降低。成囊溫度在45 ℃時包埋率（77.02%）達到最高。當溫度高于45 ℃時，包埋率明顯降低。可能溫度過高使壁材穩定性降低，微膠囊容易破碎，從而包埋率降低；但溫度過低，壁材容易凝固，包埋率也降低。結果表明，成囊溫度在35～55 ℃范圍包埋率較高。

圖2 成囊溫度對微膠囊包埋率的影響

2.4.3 復凝聚pH值對包埋率的影響 設定壁芯比為2∶1、成囊溫度為40 ℃、反應時間30 min，在不同復凝聚pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）下按“2.1”項下方法制備微膠囊，并測定包埋率，結果見圖3。復凝聚pH值為4.0時包埋率（81.87%）達到最高。因為阿拉伯膠在水中溶解帶負電，呈弱酸性。明膠屬于兩性高分子材料，當pH值低于等電點時，明膠分子電離帶正電，與帶負電荷的阿拉伯膠相互凝聚，形成微膠囊。pH高于4.0時，明膠分子所帶正電荷減少，因此微膠囊包埋率明顯降低。故復凝聚pH值在3.5～4.5時包埋率較高。

圖3 復凝聚pH 值對微膠囊包埋率的影響

2.4.4 反應時間對包埋率的影響 設定復凝聚pH值為3.5、壁芯比為2∶1、成囊溫度40 ℃，在不同反應時間（15、30、45、60、75 min）下按“2.1”項下方法制備微膠囊，并測定包埋率，結果見圖4。在15～30 min時，隨著反應時間的延長，微膠囊包埋率呈上升趨勢，在30 min時包埋率最大，為80.0%，當時間超過30 min時，微膠囊包埋率并沒有增加。當反應時間延長到75 min時，可能因為反應時間過長，已形成微膠囊粘連聚集，導致囊壁破裂，包埋率稍微降低。故反應時間固定30 min為宜。

圖4 反應時間對微膠囊包埋率的影響

2.5 星點設計-響應面法試驗

2.5.1 試驗設計 根據單因素試驗結果，選取壁芯比（A）、成囊溫度（B）、復凝聚pH值（C）3個對包埋率有顯著影響的因素為自變量，分別對以上因素進行編碼，并以微膠囊包埋率（Y）作為響應值，設計了3因素3水平共17個實驗點的響應面分析試驗，進一步優化工藝。因素和水平取值見表1。試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素及水平

表2 響應面分析方案及試驗結果

2.5.2 模型擬合及顯著性檢驗 用Design-Expert8.0軟件對所得數據進行回歸分析，對各因素經過回歸擬合后，得到回歸方程Y=83.56+0.76A+1.84B+1.39C-0.52AB+0.065AC+1.37BC-3.15A2-3.25B2-2.81C2（R2=0.989 3），方差分析見表3。模型的顯著水平（Prob＞F）明顯小于0.05，方程的失擬項P值為0.073 8，表明模型擬合度良好。A、B、C、BC、A2、B2、C2為作用顯著的影響因素，各實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。在各因素中，對包埋率影響由大到小的排列順序依次為成囊溫度、復凝聚pH值、壁芯比。

表3 方差分析表

2.5.3 響應面優化及驗證 響應面交互作用圖見圖5。3D曲面圖和對應的等高線的形狀可以直觀反映兩自變量之間交互作用的顯著性。圖5顯示壁芯比與成囊溫度兩者之間的交互作用較顯著，表現為曲面較陡，對應等高線呈橢圓形，沿溫度方向變化較快。在試驗水平下，成囊溫度對包埋率的影響比壁芯比顯著。而壁芯比和復凝聚pH值及成囊溫度和復凝聚pH值兩兩之間的交互作用不明顯，等高線近似圓形。對模型方程求一階偏導，得出模型的極值點，得到最佳制備條件為壁芯比2.1∶1、成囊溫度48.5 ℃、復凝聚pH值4.2，在此條件下微膠囊包埋率的預測值為84.15%。采用上述條件進行3次驗證試驗，實際包埋率平均值為83.55%。實際值與預測值擬合度達99.29%，表明響應面法優化的肉桂精油微膠囊制備工藝合理可行。

圖5 各因素交互作用響應面分析圖

2.6 微膠囊的紅外光譜分析 使用KBr壓片法進行試驗，將明膠、阿拉伯膠、肉桂精油、肉桂精油微膠囊分別與溴化鉀混合并充分研磨后進行壓片，紅外掃描分析[15]，波長范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為2 cm-1，結果見圖6。肉桂精油中含有肉桂醛、丁香酚等成分，具有-CHO和苯環等基團，在2 816.25、1 678.89、1 626.20、1 449.95 cm-1處存在較強的醛基和苯基的特征吸收峰（圖6D）。肉桂精油微膠囊的紅外圖譜（圖6C），可以看作是阿拉伯膠和明膠紅外圖譜的疊加，并且保留了肉桂精油的特征吸收峰1 681.36、1 450.42 cm-1，其中在3 300～3 500 cm-1內肉桂精油微膠囊對應峰的最高點是3 349.89 cm-1，說明明膠酰胺基團與阿拉伯膠中多糖攜帶的羥基形成氫鍵，從而使得C-O的伸縮振動峰向低波數移動。

圖6 紅外圖譜

2.7 微膠囊顯微形態觀察 響應面試驗優化后得到最佳制備條件下制備肉桂精油微膠囊，將肉桂精油濕微膠囊乳濁液直接滴在載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，并拍攝照片和測量粒徑。通過顯微鏡觀察可見球形微膠囊。粒徑為20～30 μm。（見圖7）

圖7 微膠囊顯微圖（×40）

2.8 微膠囊緩釋性考察 分別稱取干燥后的肉桂精油微膠囊和肉桂精油各0.5 g若干份置于玻璃平皿中，放置在80 ℃的鼓風干燥箱中模擬釋放[16]，每隔一段時間后測定肉桂精油微膠囊中肉桂精油的含量和稱定對照組肉桂精油的質量，計算肉桂精油的釋放率，以橫坐標為釋放時間，縱坐標為釋放率，繪制釋放曲線，結果見圖8。隨著加熱時間的增加，肉桂精油和肉桂精油微膠囊均有部分精油揮發釋放，但兩者的釋放率相差較大，在加熱10 h時，肉桂精油的釋放率達到75.87%，而肉桂精油微膠囊的釋放率僅為25.02%，明顯低于肉桂精油的釋放率。由此可見，肉桂精油微膠囊化可以明顯降低精油的釋放速度，有利于肉桂精油持久長效地發揮其功效。

圖8 微膠囊化的緩釋效應

3 討論

肉桂精油主要由肉桂醛等揮發性成分組成[17-18]，其在空氣中揮發性強，不耐光熱，易發生氧化分解，會影響使用效果，使其應用受到很大制約。微膠囊技術，即使用天然或人工合成的高分子材料包埋目標芯材的一門技術，可以使芯材不被腐蝕、不失活和抗氧化，增強活性物質的穩定性，有效減緩芯材的擴散和揮發[19-21]。借助微膠囊技術可以有效地控制肉桂精油緩慢釋放，并能解決肉桂精油本身的穩定性和活性持久性問題。

本研究以明膠與阿拉伯膠為壁材，肉桂精油為芯材，采用復凝聚法制備肉桂精油微膠囊。通過Box-Behnken響應面試驗，對微囊的制備工藝進行優化，得到最佳的工藝參數為壁芯比2.1∶1、成囊溫度48.5 ℃、復凝聚pH值4.2。在此條件下微膠囊包埋率的預測值為84.15%，實測值為83.55%。驗證試驗證明工藝合理可行，紅外光譜和顯微觀察證明微膠囊成功制備。緩釋性研究結果表明，微膠囊化顯著降低了肉桂精油的揮發釋放速率。本研究使肉桂精油的使用性能得到顯著提高，可為肉桂精油的進一步開發利用提供一定的參考依據。