TGF β潛態相關肽及其截短體對LX-2細胞增殖的影響

史嘉翊 宋旭東 初文竹 邱羽菲 潘 宇 曹志琴 吳 丹

(1 牡丹江醫學院生命科學學院 黑龍江 牡丹江 157011 2 牡丹江醫學院第一臨床醫學院 黑龍江 牡丹江 157011)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟損傷后進行自我修復過程中的一種反應，主要表現為在細胞外基質(extracellular matrix ECM)的累積后形成瘢痕。肝纖維化在早期階段是一種對肝損傷的自我愈合和修復，但長期的肝纖維化最終可能會演變為肝硬化，伴隨著一系列并發癥的出現，比如腹水，消化道出血，肝性腦病，最嚴重的將演變成肝癌。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β TGFβ1)是一類重要的細胞因子，它參與了生命體的分化和調節，研究證實TGFβ1是導致肝纖維化最主要的因子。

潛肽相關肽LAP(latent assotiated peptide)與TGFβ1以非共價鍵結合形成沒有活性的潛態復合物，LAP位于復合物的N端。當復合物被釋放到細胞外時，在整合素或者蛋白酶等的作用下，將LAP斷裂，釋放出具有活性的TGF-β1[1]。LAP從而具有競爭抑制TGF-β1活性從而具有抑制肝纖維化的能力。本實驗室設計了全長和截斷型兩種LAP，分別命名為LAP-F與LAP-B，并進行了表達純化。對考察其對人肝臟細胞LX-2增殖的影響，考察其細胞毒性，是否具有可以成為抗纖維化的新型蛋白藥物的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

LAP-F與LAP-B重組質粒， LX-2細胞株(中國科學院上海細胞庫)

1.2 主要試劑與儀器

蛋白胨、酵母提取物(Oxoid); 氯化鈉(Solarbio); 苯甲基磺酰氟(PMSF)(Thermo Scientific); 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(biofroxx);鎳親和層析柱(上海凱杰生物有限公司); 咪唑(Imidazole)(Solarbio) 蛋白分子量Marker (Bio-rad); DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清(HyClone); MTT試劑(Solarbio);恒溫搖床、離心機(Eppendorf); 倒置生物顯微鏡(Olympus); 二氧化碳培養箱(Thermo Scientific)。

1.3 方法

1.3.1 LAP-F和LAP-B蛋白表達純化

本課題組前期已經構建了LAP-F和LAP-B原核表達載體C43-pET28a/LAP-F和C43-pET28a/LAP-B[2]。選取大腸桿菌C43-pET28a/LAP-F和大腸桿菌C43-pET28a/LAP-B菌落中的一個在400mL滅菌LB培養基中于37℃劇烈震蕩，至OD600≈0.6的密度下進行傳代培養，將菌液按1:200的比例轉接入1000mL滅菌LB培養基中，為了高效表達目的蛋白，在16℃下我們加入終濃度為0.2mM的isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 作用16小時， 4℃，4500rpm離心15min收集菌體。在冰上超聲處理重懸菌液，并于4℃下12000rpm離心40min分離破碎菌體和上清液，并采用固化金屬親和層析純化上清液中的可溶性LAP-F和LAP-B蛋白。最終的LAP-F和LAP-B產物于4℃下在磷酸鹽緩沖液中進行透析，并通過過濾除菌。蛋白質的表達采用SDS-PAGE。

1.3.2 人類肝星狀細胞(LX-2)的培養及相關實驗

1.3.21 細胞培養

將LX-2細胞凍存管從液氮中取出并放入水浴鍋中迅速解凍。以下操作皆在生物安全柜中進行，將細胞懸液移至離心管中。800 rpm離心5 min后棄掉凍存液，加入1 mL培養基將細胞重懸加入培養瓶，之后加入培養基。CO2恒溫培養箱中繼續培養。當LX-2細胞覆蓋培養瓶瓶底約80%時進行細胞傳代。棄去瓶中的原培養基， PBS緩沖液清洗二次。加入適量胰蛋白酶溶液消化細胞。顯微鏡下觀察，當貼壁細胞原有形態消失且即將脫落則立即加入1 mL培養基終止消化。室溫下800 rpm離心5 min。棄去上清液，加入新鮮培養基重懸細胞。移至新的培養瓶中，加入適量培養基。放入CO2恒溫培養箱中培養。

1.3.3 MTT法檢測蛋白對細胞的毒性

細胞經過消化、離心、重懸后進行細胞計數。接種細胞至96孔板中，每孔100 μL培養基含細胞約5000個，空白孔中加入等體積PBS緩沖液。96孔板置于CO2恒溫培養箱中培養。待細胞完全貼壁后，按實驗分組進行給藥。分組如下：1)control組：正常培養。2)不同濃度的LAP-F組：不同濃度LAP-F(5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL, 40μg/mL, 80μg/mL, 160 μg/mL, 320μg/mL)加入細胞中進行干預。經24 h后向每孔中加入20 μL的MTT溶液在避光的條件下，之后繼續培養4h。將96孔板倒置于濾紙上，棄掉孔中液體。向各孔中加入DMSO溶液150 μL。置于避光的搖床上振蕩10 min。用酶標儀檢測OD490 nm處的吸光度，記錄結果并進行分析。3)不同濃度的LAP-B組，不同濃度LAP-B(5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL, 40μg/mL, 80μg/mL, 160 μg/mL, 320μg/mL)加入到細胞中進行干預。經24 h后向每孔中加入20 μL的MTT溶液在避光的條件下，之后繼續培養4h。將96孔板倒置于濾紙上，棄掉孔中液體。向各孔中加入DMSO溶液150 μL。置于避光的搖床上振蕩10 min。用酶標儀檢測OD490 nm處的吸光度，記錄結果并進行分析。

1.3.6 統計學處理

本研究的實驗數據分析采用GraphPad Prism 8.0軟件，每組數據以數據以平均值±標準差表示。采用分析方法進行單因素方差分析。當p值低于0.05時，數據被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 LAP-F和LAP-B蛋白純化

LAP-F和LAP-B蛋白使用Ni親和層析柱進行純化。含his標簽的重組LAP-F和LAP-B蛋白可以穩定結合Ni-NTA瓊脂糖，大部分雜蛋白和非特異性結合蛋白通過Buffer A-C清洗去除。目的蛋白采用含高濃度咪唑的Buffer D進行洗脫。SDS-PAGE結果表明LAP-B蛋白表達量明顯高于LAP-F蛋白(圖1)。

圖1 LAP-F和LAP-B蛋白的純化(1，LAP-F破碎菌液；2，LAP-F離心后上清；3，LAP-F離心后沉淀；4，LAP-F洗脫產物；M，蛋白marker；1，LAP-B破碎菌液5-8，；2，LAP-B離心后上清；3，LAP-B離心后沉淀；4，LAP-B洗脫產物)

2.2 LAP-F和LAP-B對 LX-2細胞增殖的影響

為了探討LAP-F和LAP-B蛋白是否具有細胞毒性，課題組利用MTT法探討了LAP-F和LAP-B蛋白對LX-2細胞增值的影響。將LX-2細胞按實驗設計分組進行鋪板，按設計分組加入不同濃度的LAP-F和LAP-B蛋白(5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL, 40μg/mL, 80μg/mL, 160 μg/mL, 320μg/mL)。24 h后用檢測吸光度，并計算細胞活性。結果顯示，與對照組比較，不同濃度的LAP-F和LAP-B蛋白未對細胞增殖產生影響，表明兩種蛋白在以上濃度內均不具有細胞毒性(圖2，圖3)。

圖2 LAP-F對LX-2細胞增殖的影響

圖3 LAP-B對LX-2細胞增殖的影響

3 討論

肝臟在慢性病毒或者自身的免疫炎癥的作用下，如不及時進行治療和控制，將逐漸形成肝纖維化，當肝纖維化進展到肝硬化的程度，病情將不可逆，同時干細胞也失去了其主要的功能。肝纖維化過程中，比較重要的一種因子是TGF-β1。在組織的纖維化發生和發展過程中起到了重要作用，它可以促進HSC的活化，通過刺激肌成纖維細胞合成同時分泌出ECM，從而導致人肝臟星狀細胞LX-2的纖維化。前期的研究證實，前體的狀態不具有與受體的結合的能力，它只有在改變離子強度、蛋白酶水解或者pH值的改變使LAP從TGF-β前體上游離下來，才能形成具有功能的TGF-β1，再與靶細胞表面的特異性激酶受體結合產生信號以激活TGF-β1的生物活性。而LAP同時也因具有RGD序列，使得整合素可以與其結合來調節TGF-β1的激活[3]。本實驗設計了兩種LAP蛋白，一個是全長的LAP-F蛋白，另外一個是截斷型的LAP-B蛋白。LAP-F和LAP-B兩種蛋白可以通過競爭抑制來調節TGF-β1激活，從而探討他們的抑制肝細胞纖維化的能力。

通過原核表達載體，我們成功純化出兩種可溶蛋白，LAP-F和LAP-B，同時LAP-B的表達量高于LAP-F。為了檢測兩種蛋白的安全性，我們利用MTT實驗分別對兩種蛋白的毒性進行測試，結果發現在不斷地增加劑量后，兩種蛋白依然無法對LX-2細胞的增殖產生影響，這提示我們LAP-F和LAP-B兩種蛋白不具有細胞毒性。這提示我們這兩種蛋白，尤其是LAP-B在以后對于蛋白藥物的開發和利用上具有明顯優勢，具有很好的應用前景。

綜上所述，通過競爭抑制的思路，我們找到一種LAP是可以調節TGF-β1激活的蛋白，期望其具有對肝纖維化進行治療的效果。實驗室前期通過構建原核表達的載體，通過不斷地摸索，獲得純化出兩種蛋白的最高產條件。純化出了兩種具有抗纖維化價值的蛋白類藥物LAP-F和LAP-B，本研究結果顯示截斷體LAP-B比LAP-F的產量更高，會有更好的利用前景。接下來將對兩種蛋白進行進一步更深入的抗纖維化能力研究，以及更明確的機制研究，為新型的抗纖維化蛋白藥物的開發提供新的思路。