基于αVβ3靶向雙模態分子探針對大鼠胰腺癌一體化診療的作用

孟 鑫 郝利國 谷弘謙 孟凡盛 趙添羽 李金森 王樹鵬 李麗娜

(1 齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院MR室 黑龍江 齊齊哈爾 161006 2 齊齊哈爾醫學院醫學技術學院分子影像學研究室 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

前言

分子影像學[1]是以遺傳學、生物化學、細胞生物學為基礎，從分子水平上對生物體的多種生命現象進行解釋，研究生物大分子之間相互關系和作用的一門學科[2,3]。近年來隨著納米技術的蓬勃發展，實現在分子水平上對腫瘤進行早期的無創檢查成為了可能。納米技術是指研究顆粒直徑在1-100nm范圍內的材料分子[4,5]，實驗人員通過對單個原子、分子或分子基團等納米材料的重新排列組合，從而實現獲得新材料。本實驗成功構建cRGD-Gd-Cy7-TPP探針，并實現了基于胰腺癌侵襲新生血管-血管整合素αvβ3的示蹤顯像，綜合報道如下。

1 資料與方法

1.1.1 一般資料

由齊齊哈爾醫學院動物中心提供SD大鼠30只，成功制備惡性占位模型 (胰腺癌) 30只，模型制備部分在齊齊哈爾醫學院醫學影像與生物醫學工程實驗室完成。MR分子成像部分在齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院MR室進行，設備為美國GE 750 3.0TMR。

1.1.2 儀器

儀器型號激光粒度測定儀Nicomp380ZLS,美國PSS透射電子顯微鏡HT-7700,日本日立粒度分析儀NICOMP-380ZLS,美國PSS核磁共振造影劑弛豫率分析成像系統EDUMR20-015V,蘇州紐邁電感耦合等離子體質譜-質譜儀ICP-MS,Agilent 770s,美國超純水系統Millipore Synergy,密斯博熒光倒置顯微鏡AXIO OBSERVER,德國

1.2 研究方法

1.2.1 cRGD-Gd-Cy7-TPP分子探針的合成

使用水域共熱法制備載GaCL3的脂質體，為了得到雙模態納米分子探針cRGD-Gd-Cy7，我們繼續采用薄膜分散法在其表面負載RGD環肽和熒光Cy7分子；選取卟啉類第二代光敏劑TPP，與cRGD-Gd-Cy7偶聯為cRGD-Gd-Cy7-TPP，構建診療一體化αVβ3分子探針；

1.2.2 探針表征

通過透射電子顯微鏡檢測該分子探針的粒徑，利用動態光散射法檢測其水合粒徑及zeta電位，多功能酶標儀檢測熒光耦合效應，通過熒光倒置顯微鏡和磁共振設備檢測熒光特性及磁共振成像能力，將不同濃度的探針混合瓊脂糖后重懸裝入EP管，運用熒光成像系統及3.0TMR成像系統觀察EP管中cRGD-Gd-Cy7-TPP熒光及磁共振成像能力；對EP管內的探針行T1WI序列掃描，獲得T1弛豫時間并計算得T1弛豫率。

1.2.3 細胞毒性檢驗

取正處于對數生長期的AsPc-1細胞進行CCK8增殖實驗。將細胞胰酶消化后制成細胞懸液，并進行細胞計數，以1x103/孔的密度接種于96孔板，每組設置6個副孔，加入完全培養基200ml，在副孔周圍加入適量PBS，減少培養基的蒸發。培養1d、3d、5 d、7 d、9 d后，吸取原培養基，在每個孔中加入配置好的含10% CCK8的培養基，避光，置于37°C培養箱，2h后終止培養。用酶標儀檢測在450 nm波長處的每個孔的吸光度值。實驗重復3次。

1.2.4 cRGD-Gd-Cy7-TPP靶向性檢驗

運用激光共聚焦顯微鏡驗證cRGD-Gd-Cy7-TPP的體外細胞靶向性：將PANC-1、BxPC-3細胞株與分子探針共同孵育，洗去多余探針后觀察熒光分布特點并與細胞免疫熒光結果比較。

將荷瘤鼠隨機分為靶向組及非靶向組，給靶向組荷瘤鼠經尾靜脈注射RGD-Gd-Cy7-TPP以及給非靶向組經尾靜脈注射Gd-DTPA；分別于注射前及注射后1、3、6、24h在3.0T MRI下行T1加權成像，在獲得的圖像上，將腫瘤及其相鄰的正常組織作為感興趣區域(ROI)測量信號強度，計算靶向組和非靶向組的磁共振圖像的SNR，并利用軟件比較兩組圖像的SNR；

將荷瘤鼠隨機分為靶向組及封閉組，靶向組大鼠經尾靜脈注射cRGD-Gd-Cy7-TPP探針溶液，封閉組先經尾靜脈注射過量游離cRGD多肽分子使整合素αVβ3結合位點封閉，等待5h后經尾靜脈注射相同濃度探針溶液，分別在1h、2h、6h、12h、24h時間點進行活體熒光掃描，觀察兩組模型腫瘤部位探針濃聚差異；隨后處死大鼠模型并切取腫瘤組織切片，使用組織免疫熒光法染色，從細胞組織學角度驗證cRGD-Gd-Cy7-TPP對整合素αVβ3的靶向性。

1.3 統計學方法

使用SPSS20.0(美國芝加哥SPSS Inc.)統計軟件對實驗結果進行數據處理，兩組比較采用獨立樣本，每個處理組均與對照組進行比較，采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

成功合成了探針cRGD-Gd-Cy7-TPP，分別稱取50mg、100mg、150mg、200mg樣品配制成不同濃度的cRGD-Gd-Cy7-TPP溶液，置于EP管內，靜止72h無沉著、分層現象。動態光散射法顯示探針的尺寸分布較窄，表明粒徑分布較為統一(圖1)；zeta電位較小穩定性良好。透射電鏡TEM圖像顯示：單個cRGD-Gd-Cy7-TPP納米顆粒呈圓球形結構，由于顆粒的性質，小部分有聚集現象，粒徑分布較為良好。

圖1 動態光散射法粒徑分布圖 圖3 CCK-8的腫瘤細胞活性檢驗

實驗使用西門子3.0T磁共振掃描儀進行T1WI磁共振成像，結果發現隨著cRGD-Gd-Cy7-TPP納米顆粒的濃度的升高，T1信號強度逐漸增強(如圖2)。靶向實驗結果良好，探針cRGD-Gd-Cy7-TPP對于腫瘤的檢出率高達90%。

圖2 不同濃度的cRGD-Gd-Cy7-TPP的T1WI圖像

3 討論

高軟組織分辨率、無電離輻射和無穿透深度限制等特點使磁共振成像(MRI)成為了監測腫瘤的最強有力的分子影像學診斷工具之一。近年來為了提高MRI檢查的靈敏度，在磁共振成像中對納米材料的磁共振對比劑的研究越來越深入[6]。目前臨床應用最為廣泛的T1對比劑Gd-DTPA是由德國Schefing公司主導研發的[7]。最具代表性的T2增強對比劑是超順磁性氧化鐵納米顆粒(Superparamagnetic Iron Oxide)，商品名稱為菲力磁，肝脾網狀內皮系統的單核吞噬細胞(kupffer)在其進入血液循環后迅速將其吞噬[8]。帶有靶向功能的Gd分子探針在應用于MRI時有對比度更佳、選擇性富集靶器官和組織、高組織選擇性和組織特異性、體內持續適當的時間(避免了在肝臟中的網狀細胞很容易吞噬超順磁性氧化鐵納米顆粒從而排出體外的情況)等技術優勢。

外科醫生利用熒光顯像實現手術的可視化多虧了近紅外熒光成像技術的作用，并相對準確的描繪腫瘤輪廓和切除腫瘤。近紅外熒光成像具有高靈敏度的特點，但是其探測效果受組織深度影響較大[9]。目前，分子成像領域的三大主要技術磁共振成像、化學發光法和放射性核素成像[10]。

經研究發現腫瘤新生血管起到了重要作用在腫瘤遠處轉移的過程中，學者們經過更深入研究發現，在多種惡性腫瘤組織中整合素αVβ3均有高表達，且整合素αVβ3表達量與腫瘤新生血管的形成成正相關，介導了腫瘤的侵襲及遠處轉移[11]。首先，由于整合素αVβ3的引導作用使得金屬蛋白酶2及纖維溶蛋白酶大量聚集并激活，破壞了血管基底膜，腫瘤細胞得以遷徙。有研究表明:腫瘤新生血管的未形成使得瘤體大小只能局限在數毫米的范圍內[12]。同時，整合素αVβ3的粘附作用可以加速血管內皮細胞的運動，加快了腫瘤新生血管的生成速率。血管的生成與血管生長因子的分泌密切相關，整合素αVβ3與多種生長因子緊密相關已經被多項研究證明[13]。其中研究最為廣泛的一種生長因子是血管內皮生長因子(VEGF)，其在新生血管生成過程中起到了決定性作用。有學者在針對膠質母細胞瘤的研究中發現，在膠質母細胞瘤新生血管生成過程中，一方面檢測到了內皮生長因子在血管內表達的增高，同時在另一方面也檢測到了整合素αVβ3表達的增高[14]；當研究人員抑制血管內皮生長因子表達時，整合素αVβ3的表達水平也同樣受到了抑制 。通過激活非配體依賴的血管內皮生長因子信號通路，整合素αVβ3主管可以調節腫瘤血管生成，即使在使用外源性血管生成抑制劑時，整合素αVβ3分子仍能夠發揮促進腫瘤新生血管的形成作用 。

整合素αVβ3在整合素有著重要地位，其在腫瘤新生血管內皮細胞表面高度表達，而且在多種腫瘤細胞表面均有高度表達，但在普通上皮細胞和成熟血管內皮細胞表面卻不表達或呈低水平表達的。αvβ6整合素的表達與根植于或與轉化生長因子β信號改變相關的疾病密切相關。這也是本課題組以后研究項目的重點。

本課題實驗利用新型的納米技術和生物化學技術可以實現靶向組件和信號組件的偶聯，從而實現αVβ3的特異性顯像。本課題實驗采取多模態相互融合的醫學影像分子影像技術，開創性的研發了一種整合素αVβ3靶向的磁共振/熒光雙模態分子探針。該分子探針既可以實現在宏觀方面實現對腫瘤解剖層面的精準檢測，同時又可以在分子代謝層面對腫瘤的診斷，治療以及預后進行判斷，為胰腺癌αVβ3表達水平的精準檢測提供一種極為方便的實時動態觀測的手段。