基于分子影像學評價STAT3因子在肺腺癌治療中的作用

郝利國 佟 旭 李國華 谷弘謙 李忠濤

(齊齊哈爾醫學院醫學技術學院分子影像學研究室 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

肺癌是人類發病率和死亡率都比較高的腫瘤疾病之一，其中早期肺腺癌診斷是最常見的一種肺癌臨床病理學診斷類型[1]。早期肺腺癌一般生長緩慢，倍增持續時間長，可伴惡性血行細胞轉移,臨床診斷治療初期效果欠佳[2]。近年來，以早期肺腺癌患者相關病理分子腫瘤標志物檢測為治療目標的分子檢測治療方式為早期肺腺癌的發病風險評估、及惡性腫瘤早期監測治療賦予了希望，研究發現早期惡性肺腺癌的相關病理因子分型在不同腫瘤發展周期階段之間存在異質性，這對于早期肺腺癌的早期預防診斷治療具有重要指導意義[3-4]，而通過研究高能X射線誘導肺癌細胞早衰，分析其分子層面的早衰機制，將為臨床診治肺癌提供啟示性方向。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 細胞培養：人肺腺癌腫瘤A549細胞；新型人源性肺癌腫瘤h1299細胞；細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中，連續進行低溫培養，所有試劑均用去離子水配置。

1.1.2 主要儀器設備：激光粒度定量測定儀；透射電子顯微鏡；細胞培養箱；低速臺式細胞離心機；智能熒光酶標倒置電子顯微鏡；多功能熒光酶標儀

1.2 細胞實驗

取兩個細胞對數生長期的細胞H1299和細胞A549細胞,使用直線加速器對細胞進行直線照射,SSD=100cm,細胞吸收的高能量照射濃度為10mV。A549細胞為貼壁細胞,瓶底中心點和細胞中心點吸收劑量分別為0gy、2gy、4gy以及8gy，分為兩個單數對照組和一個對照組。每組以105/ml板平鋪于6孔板中，每孔分別加入2ml的細胞培養液，對照組不需要做染色處理，AG490組分別加入終止總濃度為20μm/ml的AG490抑制藥試劑，RAPA組分別加入終止總濃度為1μm/ml的RAPA抑制藥試劑，于24h、48h及72h分別進行兩組β-半胱葡乳糖酸染色計數；同時將4gy組進行同劑量照射的3組細胞提取受體細胞,4gy組、4gy+AG490組分別進行加入終止總藥物濃度為20μm/ml的AG490抑制性抗藥照射試劑、4gy+RAPA組分別進行加入終止總藥物濃度為1μm/ml的抑制性抗藥照射試劑，對照組提取細胞；0gy組進行相同劑量進行照射，于72h收取進行提取受體細胞，兩組細胞提取受體細胞中的蛋白質，均可應用于自體免疫細胞蛋白質和自體免疫細胞中的印跡特征染色抑制實驗。

1.3 細胞衰老率檢測

將H1299和A549細胞培養溶液均勻鋪于24孔板中，加入250μl的β半胱葡乳糖酸核苷酶溶液作為下次染色固定液，室溫固定30min后加入250μl重的染色細胞工作液，避免反光用白色保鮮膜緊緊封住24孔板隙以防止溶液蒸發。37℃在保溫箱染色孵育細胞過夜后，加入0.5ml的染色PBS，普通的熒光學者在顯微鏡下實時觀察細胞染色實驗結果并進行計數，統計其對β半胱葡乳糖酸核苷酶染色陽性細胞的染色百分比。

1.4 細胞轉染

H1299和細胞A549細胞培養至對數期后,以106/ml培養方式將其種植于6孔板中,每孔一次后再加入2ml的細胞培養液,待每次加入后的培養細胞融合度70%時,進行質粒蛋白細胞進行遷移接受轉移感染,用于檢測細胞免疫蛋白表達，以及檢測質粒細胞血球蛋白免疫細胞表達。

1.5 蛋白質印跡

細胞中的主要細胞裂解蛋白上清裂解液主要提取裂解于原細胞中的H1299和次要裂解細胞A549細胞，加入乙酰氨基酸二磷酸酶催化裂解反應抑制劑，及其他細胞上清蛋白酶催化裂解反應抑制液試劑，5%濃度室溫分離脫脂奶粉成膜采用濃度室溫高壓加熱方式封閉60min,使用多維激光濃度增強化學發光成像掃描儀方法即可進行圖像顯色，以βactina作為主要成像內參,imageoc圖像濃度分析效果圖本應用軟件進行圖像濃度分析主要研究目的也就是測定血蛋白的各種生物化學表達以及濃度測定水平。

1.6 統計學方法

采用兩組差異樣本配對，比較方法采用t方法進行配對檢驗,以差異配對結果p<0.05為結果計算出的差異配對值具有效的結合統計學習和現實意義。

2 結果

加入新的STAT3磷酸化物作為抑制劑后，以及加入AG490同樣均可顯著有效上調抑制腫瘤細胞H1299和A549細胞的腫瘤生長晚期早衰，加入STAT3可顯著抑制促進腫瘤細胞生長H1299和其在新的A549細胞內的生長早衰。高能活性x光激光細胞照射在癌細胞中均可顯著有效抑制上調腫瘤細胞生長；AG490和新的原有rapa同樣顯著有效抑制了高能活性使用x射線光電子輻射線微波激光細胞誘導的腫瘤細胞H1299和其在新的A549細胞內的生長早衰。(如圖1)

圖1 實驗組和對照組中STAT3、53和P16的表達情況

成功建立以STAT3為把靶點的探針，分別稱取50mg、100mg、150mg、200mg樣品配制成不同濃度的溶液,置于5ml離心管內，靜止72h無渾濁、分層現象。探針的尺寸分布較窄,表明粒徑分布較為統一(圖1)。

zeta電位穩定性良好，隨著成像探針的輻射濃度的逐漸升高，T1信號強度逐漸增強(如圖2)。靶向實驗結果良好，探針對于腫瘤的檢出率高達90%，且隨STAT3表達的增加而增加,可以有效實現癌癥的早期診斷。

注：左圖為不同濃度下的探針T1WI成像圖像

注：左圖為探針粒徑分布直方圖

3 討論

STAT3因子是一種介導腫瘤細胞間遺傳信號轉導的重要細胞轉錄激活因子，參與腫瘤細胞基質分化、免疫代謝應答、胚胎生長發育等多種細胞生理活化過程[5]。近年來,大量臨床研究成果顯示,STAT3在多種惡性腫瘤中異常轉錄活化，并與惡性腫瘤上皮細胞的異常增殖、凋亡、轉移等多種生物學生理行為緊密密切相關[6]。衰老是阻止癌細胞增殖的腫瘤抑制機制，氧化損傷、端粒功能障礙、電離輻射引起的DNA損傷反應和化療藥物都可引起不可逆的細胞衰老 。2015年science的一百多篇文章 分別提出目前已知的肺癌細胞周期早衰相關通路主要有三條,分別由三條p16、p53、p62介導,其中p16、p53通過誘導影響細胞周期早衰停滯進而誘導引起其他細胞周期早衰，基于上述相關研究結果，提示我們在使用x和放射線因子誘導治療肺腺癌后的細胞周期早衰中，STAT3和放射線因子誘導的肺癌細胞周期早衰相關通路最有可能為三條STAT3-cav1-p53、STAT3-p16等而關鍵因子為STAT3 。此外，STAT3還與腫瘤細胞的輻射抗性有關，抑制STAT3表達能使一些腫瘤細胞的輻射敏感性增強 。其中基于STAT3的介導抗藥性凋亡基因機制可能是通過輻射后導致A549細胞內在放射線中抗性濃度增加的重要原因之一，但STAT3介導的輻射影響導致A549細胞通過輻射產生抗性的基因機制目前還不明確。

本文的研究結果發現新的STAT3參與H1299和A549細胞慢性早衰的正常調控，高能量的x射線細胞照射技術可通過細胞激活新的STAT3，誘導舊的H1299和新的A549細胞從而發生慢性早衰。成功建立以STAT3為把靶點的探針,可以有效實現肺腺癌的早期診斷。

肺癌前期檢查無明顯的臨床癥狀，進展迅速，因而早期手術率和切除率低。此外，術后的局部細胞復發及遠處細胞轉移，導致其臨床療效不佳，阻斷性的STAT3信號分子通路發展可以顯著用于改善惡性胰腺癌腫瘤細胞的早期生物學分化行為，因此阻斷STAT3信號分子通路可能發展成為目前治療惡性胰腺癌的重要藥物治療方式 。綜上所述，對Jak/STAT3信號分子通路技術進行更深入的科學研究，能夠為促進胰腺癌的早期治療發展提供新的治療方法。電離輻射因素會誘發一些患早期肺癌的干擾體細胞發生慢性晚期早熟衰老[13]。但目前的一些臨床醫學研究僅限于分別揭示肺癌細胞慢性早衰現象，而對其更上游的與慢性早期放射性干細胞功能損傷早期肺癌細胞發生反應密切的相關聯的肺癌細胞基質調節機制，以及下游的被細胞激活后的早衰肺癌細胞對該蛋白的受體調節反應機制研究較少。這也是我們下一步的醫學臨床研究中的重點。