獸用清肺排毒湯質量標準研究

車曉菲，王紅志,2 ，汪 令,2，趙雙志 ，王 露,2 ，趙兵令,2★

（1.河北維爾利動物藥業集團有限公司 050200；2.河北省中獸藥產業技術研究院 050200；3.河北省功能性添加劑技術創新中心 050200）

清肺排毒湯由《傷寒雜病論》中的麻杏石甘湯、射干麻黃湯、小柴胡湯、五苓散等經典方優化組合而來，在抗擊新冠疫情中發揮了重要作用。獸用清肺排毒湯是受清肺排毒方對中獸藥的啟發，考慮到相應病癥對組方進行調整而得[1]。其組方在清肺排毒湯的基礎上，結合了普濟消毒飲[2]、宣白承氣湯[3]、苓桂術甘湯[4]等經典方劑，由麻黃、黃芩、連翹、大黃、厚樸、山藥、白術、魚腥草、石膏等24種藥材按規定工藝制備而成，用于黑肺、爛肺、肺熱、痰熱壅肺證。考慮到獸用清肺排毒湯組方復雜，為科學有效的控制產品質量，我們通過檢索相關質量標準，制定了如下研究方案：（1）參考《中國獸藥典》[5]中藿香正氣口服液的“鑒別”方法，通過TLC法定性鑒別厚樸。（2）參考《中國獸藥典》中大黃藥材的“鑒別”方法，通過TLC法定性鑒別大黃。（3）參考《中國獸藥典》中黃芩藥材的“含量測定”方法，測定黃芩苷含量。（4）參考《中國獸藥典》麻杏石甘口服液的“含量測定”方法，測定鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的總含量。（5）參考《中國獸藥典》中連翹藥材的“含量測定”方法，測定連翹苷含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260 Infinity II高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），DAD檢測器，OpenLab CDS VL 工作站 ；AUW120D型電子天平（日本SHIMADZU公司）；DK-98-Ⅱ電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）。

1.2 對照品與試劑

厚樸酚對照品（批號110729-202015 含量99.0%）；和厚樸酚（批號19032102 含量99.96%）；厚樸對照藥材（批號121285-201303）；大黃對照藥材（批號120984-201202）；大黃酸對照品（批號110757-201607 含量99.3%）；黃芩苷對照品（批號110715-201821 含量95.4%）；鹽酸麻黃堿對照品（批號171241-201809 含量100.0%）；鹽酸偽麻黃堿對照品（批號171237-201510 含量99.8%）；連翹苷對照品（批號110821-201816 含量95.1%），上述對照品及對照藥材除和厚樸酚購于成都普菲德生物技術有限公司外，均來自中國食品藥品檢定研究院。HPLC法中，甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為娃哈哈水。其他試劑均為分析純。

1.3 藥材與樣品制備

1.3.1 藥材

麻黃、黃芩、連翹、大黃、厚樸、山藥、白術、魚腥草、石膏、苦杏仁、水半夏、瓜蔞、生姜、茯苓、射干、紫苑、桑白皮、枳殼、陳皮、丹參、升麻、馬鞭草、仙鶴草、桔梗等均采買于河北華都藥業有限公司，質量均符合《中華人民共和國獸藥典》2020版（二部）的有關規定。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 獸用清肺排毒湯樣品制備：麻黃30g，連翹45g，大黃30g，厚樸30g，山藥30g，白術30g，魚腥草45g，石膏150g，水半夏45g，瓜蔞45g，生姜30g，茯苓45g，射干45g，紫菀30g，桑白皮45g，枳殼30g，陳皮30g，丹參45g，升麻45g，馬鞭草30g，仙鶴草45g，桔梗30g，共計22味，加水煎煮，提取2次。第一次2h加水8倍量，煮沸后加入黃芩45g，苦杏仁30g，第二次提取1h，加水6倍量。煎煮過程中收集蒸餾液,藥液合并濾過，減壓濃縮，冷藏靜置24h，過濾，濾液加水至1000mL，即得。

1.3.2.2 厚樸對照藥材煎煮液：取厚樸對照藥材2g，加水30mL，加熱回流3h，濾過，濾液濃縮至5mL，備用。

1.3.2.3 藥材單提液溶液：大黃、黃芩、麻黃、連翹等藥材各自按“1.3.2.1”項下相關規定制備。

1.3.2.4 陰性樣品制備：除目標藥材外，其余藥材按“1.3.2.1”制備工藝進行處理。

2 試驗方法與結果

2.1 TLC定性鑒別

2.1.1 厚樸的薄層鑒別

參考藿香正氣口服液進行研究：取獸用清肺排毒湯（批號：20210401）樣品20mL，用石油醚（30℃～60℃）置分液漏斗中振搖提取2次，每次加入25mL，合并石油醚液，低溫蒸干（50℃以下），殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液。取厚樸對照藥材煎煮液，同法制成對照藥材溶液。另取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品，分別加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2020版中國獸藥典附錄0502）試驗，吸取上述三種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-甲酸（17:3:0.4）為展開劑，展開，取出，晾干。顯色：噴以5%香草醛硫酸溶液，在100℃加熱至斑點顯色清晰。結果：供試品色譜中，在與厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，分離度良好；陰性樣品無干擾；對照藥材溶液上下沿斑點Rf值未達到要求，不作為參考依據。結果見圖1：

圖1 獸用清肺排毒湯中厚樸的TLC圖

結果表明：該方法中厚樸酚、和厚樸酚作為目標成分專屬性符合要求，可作為厚樸的鑒別依據。

2.1.2 大黃的薄層鑒別

取獸用清肺排毒湯（批號：20210401）樣品20mL，蒸干，干膏加甲醇20mL，超聲處理10min進行提取，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加水10mL使全部溶解，再加鹽酸1mL，加熱回流30min，立即冷卻，轉移至分液漏斗中，用乙醚分2次振搖提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1mL使溶解，作為供試品溶液。對照藥材、對照品參照《中國獸藥典》中大黃藥材的薄層鑒別系統進行檢驗。結果：供試品色譜中，在與大黃對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；在與大黃酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點。同時，進行大黃陰性樣品、大黃藥材的檢測。結果見圖2：

圖2 獸用清肺排毒湯中大黃TLC圖

結果表明：陰性樣品無干擾，該方法專屬性符合要求；供試品及藥材斑點清晰，可作為大黃的鑒別依據。

2.2 含量測定

2.2.1 黃芩含量測定（以黃芩苷含量計）

2.2.1.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動相：甲醇-水-磷酸（47:53:0.2）；流速：1.0mL/min；檢測波長：280nm；理論塔板數按黃芩苷峰計算應不低于2500。柱溫：室溫；進樣量：10μL。

2.2.1.2 對照品溶液及供試品溶液的制備

對照品溶液的制備：取在60℃減壓干燥4h的黃芩苷對照品約15mg，精密稱定，加甲醇稀釋250倍，制成每1mL約含60μg的溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：精密量取供試品2mL，置25mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。同時，按供試品溶液的制備方案，處理黃芩陰性樣品以及黃芩單提液。

上述對照品溶液及供試品溶液過0.45μm濾膜，濾液裝入液相小瓶，備用。

2.2.1.3 專屬性考察

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、黃芩陰性樣處理液、黃芩單提液處理液各10μL，按“2.2.1.1”項下規定的色譜條件進行測定，考察此方法專屬性是否符合要求。結果見圖3。

圖3 黃芩含量測定

結果表明：陰性樣品對黃芩苷主峰無干擾，該方法專屬性符合要求。

2.2.1.4 線性關系考察

精密稱取在60℃減壓干燥4h的黃芩苷對照品15.08mg（含量95.4%），置50mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取6份對照品儲備液，每份5.0mL，分別置于200mL、100mL、50mL、25mL、10mL、5mL的容量瓶中，依次加甲醇定容，搖勻，作為對照溶液。依次精密量取對照溶液10μL，按“2.2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積數值。以對照品濃度作為橫坐標（X，μg/mL）,黃芩苷色譜峰的峰面積作為縱坐標（Y，mAU*S），進行線性回歸計算，考察線性關系范圍。

回歸方程為：Y=34.568X+53.18 （R2=0.9996）

結果表明：該方法在黃芩苷7.1932～287.73μg/mL的濃度范圍內線性關系符合要求。

2.2.1.5 準確度考察

精密量取“2.2.1.4”項下制備的對照儲備液5.0mL，置25mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為對照溶液。取樣品3瓶（批次：20210401）作為供試品，每瓶取樣2.0mL組成1組。第一組加對照溶液1.0mL，第二組加對照溶液2.0mL，第三組加對照溶液5.0mL，按“2.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1.1”項下色譜條件下測定。記錄峰面積并計算回收率，考察方法的準確度。測得黃芩苷的回收率均在98%～102%之間。詳見表1：

表1 黃芩苷回收率測定結果統計表

結果表明該方法準確度符合要求。

2.2.1.6 精密度考察

取同一液相小瓶中的供試品溶液，按規定的色譜條件，連續進樣6次，記錄黃芩苷色譜峰峰面積，計算峰面積的RSD值，考察此方法的精密度。

結果測得黃芩苷色譜峰峰面積RSD值為：0.16%，表明該方法精密度良好，符合要求。

2.2.1.7 重復性考察

取同一批樣品3瓶（批次：20210401）作為供試品，第一組分別取樣1.0mL，第二組分別取樣2.0mL，第三組分別取樣3.0mL，共計9份樣品。按“2.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1.1”項下色譜條件下測定，計算黃芩苷的含量，考察方法的重復性。結果詳見表2.

表2 黃芩苷含量測定結果統計表

結果表明：該方法測定黃芩苷含量重復性良好，符合要求。

2.2.1.8 穩定性考察

取同一液相小瓶的供試品溶液，自其第一次進樣起計時，間隔2h,4h,8h,12h,18h,24h各進樣1次，記錄黃芩苷色譜峰峰面積，并計算其RSD值，考察方法的穩定性。

結果測得黃芩苷色譜峰峰面積RSD值為：0.22%，表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.2.2 麻黃含量測定（以鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的總量計）

2.2.2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（含0.1%三乙胺）（3:97）；檢測波長：207nm；理論塔板數按鹽酸麻黃堿峰計算應不低于4000；柱溫：室溫；進樣量：10μL。

2.2.2.2 混合對照品及供試品溶液的制備

混合對照品溶液的制備：分別取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品約10mg，精密稱定，置同一50mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液定容，搖勻；精密移取5.0mL，置50mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：精密量取供試品10mL，置150mL碘量瓶中，加濃氨試液10mL，精密加入三氯甲烷50mL，稱定重量，超聲處理20min，時時振搖，放冷，加三氯甲烷補足減失的重量，搖勻，精密量取下層三氯甲烷液25mL，加鹽酸乙醇溶液（1→20）4mL，減壓回收三氯甲烷至干，殘渣加0.1mol/L鹽酸溶液使溶解，轉移至25mL量瓶中，容器分次洗滌，洗液并入同一量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液定容，搖勻，即得。同時，按供試品溶液的制備方法，處理麻黃陰性樣品以及麻黃單提液。

上述溶液過0.45μm濾膜，濾液裝入液相小瓶，備用。

2.2.2.3 專屬性考察

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、麻黃陰性樣品處理液、麻黃單提液處理液各10μL，按“2.2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，對專屬性進行考察。結果見圖4。

圖4 麻黃含量測定

結果表明：陰性樣品w對測定無干擾，該方法專屬性符合要求。

2.2.2.4 線性關系考察

精密稱取鹽酸麻黃堿對照品11.06mg（含量100.0%）、鹽酸偽麻黃堿對照品10.39mg（含量99.8%），置同一50mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定容搖勻，作為混合對照品儲備液。精密量取儲備液5.0mL，分別置200mL、100mL、50mL、25mL、10mL、5mL容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液定容搖勻，作為對照溶液。按“2.2.2.1”項下色譜條件進樣測定，分別記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積。以濃度作為橫坐標（X，μg/mL）,峰面積作為縱坐標（Y，mAU*S），進行線性回歸計算。

鹽酸麻黃堿的回歸方程為：Y=20.43X+8.3229 （R2=0.9999）

鹽酸偽麻黃堿的回歸方程為：Y=20.452X-4.5099（R2=0.9995）

結果表明：該方法在鹽酸麻黃堿濃度為5.5300～221.20μg/mL、鹽酸偽麻黃堿濃度為5.1846～207.38μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.2.5 準確度考察

精密量取“2.2.2.4”項下對照儲備液5.0mL，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋并定容至50mL，作為混合對照溶液。取3瓶樣品（批次：20210401）作為供試品，每瓶平行取樣3份，每份精密量取10.0mL。3瓶各取1份組成一組，第一組加混合對照溶液1.0mL，第二組加混合對照溶液2.0mL，第三組加混合對照溶液5.0mL，分別按“2.2.2.2”、“2.2.2.1”項下規定進行測定。記錄峰面積并計算回收率，考察方法的準確度。測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的回收率均在98%～102%之間。詳見表3、表4：

表3 鹽酸麻黃堿回收率測定結果統計表

表4 鹽酸偽麻黃堿回收率測定結果統計表

結果表明：此方法中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的回收率良好，準確度均符合要求。

2.2.2.6 精密度考察

取同一液相小瓶的供試品溶液，連續進樣6次，記錄鹽酸麻黃堿色譜峰、鹽酸偽麻黃堿色譜峰的峰面積，計算峰面積的RSD值，考察方法的精密度。

結果測得鹽酸麻黃堿峰面積RSD值為：0.12%，鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD值為：0.19%，表明該方法精密度良好。

2.2.2.7 重復性考察

取同一批樣品（批次：20210401）3瓶，分別取樣，分組如下：第一組取樣量5.0mL，第二組取樣量10.0mL，第三組取樣量15.0mL，按“2.2.2.2”、“2.2.2.1”項下規定進行測定，分別計算含量及RSD值，考察方法的重復性。結果詳見表5、表6、表7。

表5 鹽酸麻黃堿含量測定結果統計表

表6 鹽酸偽麻黃堿含量測定結果統計表

表7 鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿總量測定結果統計表

結果表明：該方法測定鹽酸麻黃堿含量、鹽酸偽麻黃堿含量及兩者的總量重復性良好。

2.2.2.8 穩定性考察

取同一液相小瓶的供試品溶液，分別于0h，2h，4h，8h，12h，18h，24h進樣1次，記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積，并計算峰RSD值，考察該方法的穩定性。

結果測得鹽酸麻黃堿峰面積RSD值為：0.21%，鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD值為：0.28%，表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.2.3 連翹含量測定（以連翹苷計）

2.2.3.1 色譜條件

色譜柱：C18柱；流動相：乙腈-水（25:75）；檢測波長：277nm；理論塔板數按鹽酸麻黃堿峰計算應不低于3000。柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.2.3.2 對照品溶液及供試品溶液的制備

對照品溶液的制備：取連翹苷對照品約20mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加甲醇使溶解并定容，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：精密量取供試品5mL，置25mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。同時，按供試品溶液的制備方案，處理連翹陰性樣品以及連翹單提液。

上述對照品溶液及供試品溶液過0.45μm濾膜，濾液裝入液相小瓶，備用。

2.2.3.3 專屬性考察

按“2.2.3.1”、“2.2.3.2”項下規定，進行對照品溶液、供試品溶液、連翹陰性樣處理液、連翹單提液處理液測定，記錄色譜圖，對專屬性進行考察。結果見圖5。

圖5 連翹含量測定

結果表明，陰性樣品對測定無干擾，該方法專屬性符合要求。

2.2.3.4 線性關系考察

精密稱取連翹苷對照品20.12mg（含量95.1%），加甲醇溶解并定容至10mL，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取儲備液6份，每份1.0mL，依次加甲醇稀釋至100mL、50mL、25mL、10mL、5mL、2mL，作為對照溶液，按“2.2.3.1”、“2.2.3.2”進行測定，記錄峰面積。以濃度作為橫坐標（X，μg/mL）,峰面積作為縱坐標（Y，mAU*S），進行線性回歸計算。

回歸方程為：Y=6.3554X-9.7904 （R2=0.9997）

結果表明：該方法在連翹苷19.1341～956.706μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.2.3.5 準確度考察

精密量取“2.2.3.4”項下對照儲備液1.0mL，加甲醇稀釋并定容至10mL，作為對照溶液。取同一批（批次：20210401）3瓶樣品作為供試品，每瓶平行取樣3份，每份精密量取2.0mL。3瓶各取1份組成1組，第一組加對照溶液1.0mL，第二組加對照溶液2.0mL，第三組加對照溶液5.0mL，按“2.2.3.2”、“2.2.3.1”項下規定進行測定。記錄9份樣品的連翹苷峰面積，計算其回收率，考察方法的準確度。結果詳見表8。

表8 連翹苷回收率測定結果統計表

結果測得連翹苷的回收率均在98%～102%之間，表明該方法準確度符合要求。

2.2.3.6 精密度考察

取同一液相小瓶的供試品溶液，連續進樣6次，記錄連翹苷峰面積，計算其RSD值，考察此方法的精密度。

結果測得連翹苷峰面積RSD值為：0.22%，表明該方法精密度良好。

2.2.3.7 重復性考察

取同一批樣品（批次：20210401）3瓶，分別取樣。第一組分別取樣5.0mL，第二組分別取樣10.0mL，第三組分別取樣15.0mL，置于50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容。按“2.2.3.1”項下規定的進行測定，計算連翹苷的含量及RSD值，考察方法的重復性。結果詳見表9。

表9 連翹苷含量測定結果統計表

結果表明：該方法測定連翹苷含量重復性良好。

2.2.3.8 穩定性考察

取同一液相小瓶的供試品溶液，自第一次進樣計時，分別于2h,4h,8h,12h,18h,24h進樣1次，記錄連翹苷峰面積并計算RSD值，考察方法的穩定性。

結果測得連翹苷峰面積RSD值為：0.27%，表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.3 樣品測定

取6批樣品，每批平行樣個數n=3，分別按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”項下規定制備供試品溶液，并按相應色譜條件進行測定，計算含量。結果見表10。

表10 各成分含量測定結果

3 討論

獸用清肺排毒湯組方中有24味藥材，作為大組方制劑，在制定質量標準時實驗條件的篩選困難重重。在進行TLC薄層色譜條件的摸索中，對山藥、白術、魚腥草也進行嘗試，除藥材方法外，山藥嘗試了健脾肥兒口服液系統[6]、健胃消食片系統[7]；白術嘗試了五味健脾合劑[8]、五苓散系統[9]；魚腥草嘗試了魚腥草配方顆粒系統，但因重現性差、陰性樣品干擾、目標成分與工藝不匹配等因素，未能篩選出符合要求的實驗條件。

中藥復方制劑中化學成分復雜，所以其質量評價應進行多組分含量檢測。在獸用清肺排毒湯處方中，黃芩具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效；麻黃具有解表散寒，宣肺平喘，利水消腫的功效；連翹具有清熱解毒，消腫散結的功效。查閱文獻[10-15]發現三者在其他制劑中常作為目標成分，HPLC分析條件較成熟，經方法學驗證，篩選出了適用于黃芩苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、連翹苷含量測定的實驗條件。

中醫藥理論強調的是整體觀念。通過對獸用清肺排毒湯的檢驗方法研究，使得我們對大組方制劑的質量標準建立有了進一步的認知，將繼續加深中藥復方制劑藥效與質量之間的關系探索。

4 結論

獸用清肺排毒湯是優秀的中獸醫藥工作者受“清肺排毒方”啟發，強化中獸醫藥經書經方的學習與研究，結合經典方劑而制定。為了控制產品質量，對厚樸、大黃的TLC定性鑒別和黃芩、麻黃、連翹的HPLC含量測定進行研究，結果表明此方法符合“獸藥質量標準分析方法驗證指導原則”要求，可為獸用清肺排毒湯提供有效的質量控制。