鹽酸阿霉素通過DRP1/FUNDC1信號通路調節線粒體動力學誘導大鼠慢性心力衰竭

夏 冉，朱國旗，高 兵，汪 恒，朱 夢，李凌基，王 祝，王 莖，戴小華

(安徽中醫藥大學 1.中醫學院、2.針炙推拿學院、3.新安醫學教育部實驗室，安徽 合肥 230038；4.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031)

癌癥的發病率、住院率及死亡率逐年上升，全球估計13.1億人將于2030年死于癌癥[1]。鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)是一種非選擇性Ⅰ類強效蒽環類抗生素，具有廣譜抗腫瘤活性作用，但因其心臟毒性作用，使用過程中易造成不可逆的充血性心力衰竭，導致臨床使用受限[2]。

研究發現，DOX是一種線粒體毒素，線粒體損傷是DOX誘導的心臟功能障礙和細胞死亡的核心[3-4]。線粒體依賴于動力蛋白家族GT Pases調節，正常情況下，線粒體通過融合產生能量；而在應激條件下，線粒體通過分裂將受損的線粒體分離出來進行自噬清除[5]。因此，線粒體的融合與分裂對于維持心肌細胞穩態和心臟健康至關重要。然而，過度的分裂會損害心肌細胞，導致心室重構[6]。在課題組前期研究中發現，阿霉素在復制大鼠模型時，心肌細胞凋亡及自噬水平均有所上升[7-8]。因此，我們猜測DOX可能通過線粒體動力學導致心肌細胞死亡引發心力衰竭。

臨床表明，心力衰竭的嚴重程度與抗癌治療過程中累積的DOX劑量相關[9]。為了避免實驗誤差，本研究采用DOX腹腔注射不同劑量構建大鼠心衰模型[10]，通過超聲心動圖、B型腦鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)及心肌病理檢測判定心衰發展程度，并選出最優劑量組。再聯用線粒體分裂抑制劑Mdivi-1，通過Western blot檢測大鼠相關動力學蛋白指標及涉及的相關信號通路分子改變，探索DOX誘導心衰的發生機制，為臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料動物：SPF級SD ♂大鼠(200～250) g，84只，購于山東省實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(魯)20190003。飼養于安徽中醫藥經絡研究所大學動物房(清潔級)，所有實驗均根據實驗動物護理指南進行。本研究獲得安徽中醫藥大學動物倫理委員會批準，批準號為AHUCM-rats-2020026。

1.2 藥品與試劑注射用鹽酸阿霉素(10 mg/支，山西普德藥業股份有限公司)，Mdivi-1(25 mg/支，上海碧云天生物技術有限公司)；兔多抗DRP1(ab184247，英國Abcam公司)；兔多抗OPA1(bs-11764R，北京博奧森生物技術有限公司)，兔多抗FUNDC1(A16318，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；大鼠B型腦鈉肽(BNP)酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL底物液(武漢賽維爾生物有限公司)。

1.3 儀器電子天秤：梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)；酶標檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發公司)；電泳儀電源(北京六一儀器廠)；脫色搖床(武漢賽維爾生物科技有限公司)；磁力攪拌器(武漢賽維爾生物科技有限公司)；轉印電泳儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；感光膠片(愛普生有限公司)，Philips SONOS 5500超聲儀(荷蘭Philips公司)。

2 方法

2.1 分組與干預實驗一：SD大鼠適應性飼養1周后，將大鼠隨機分為Control組(n=12)、DOX 1組(n=12)、DOX 2組(n=12)、DOX 3組(n=12)。Control組等體積腹腔注射生理鹽水；DOX各組均采用DOX交替腹腔注射，將阿霉素與0.9% 氯化鈉溶液制備成注射液(1 mg·mL-1)，根據大鼠體質量，DOX 1組以2 mg·kg-1注射DOX，1次/周，共6周，累計劑量達到12 mg·kg-1；DOX 2組以2.5 mg·kg-1注射DOX，1次/周，共6周，累計劑量達到15 mg·kg-1；DOX 3組以3 mg·kg-1注射DOX，1次/周，共6周，累計劑量達到18 mg·kg-1[11]。實驗二：SD大鼠適應性飼養1周后，將大鼠隨機分為Control組(n=12)、DOX 2組(n=12)、DOX 2+Mdivi-1組(n=12)，Control、DOX 2組實驗方法同前，DOX 2+Mdivi-1組在累計劑量達到15 mg·kg-1后，予以每日交替腹腔注射Mdivi-1(1 mg·kg-1)，干預3周。

2.2 超聲心動圖檢查實驗一結束后，以生理鹽水制備3%戊巴比妥鈉溶液，按30 mg·kg-1給予大鼠腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，將大鼠仰臥位固定于鼠架板，胸部脫毛處理并涂抹超聲偶合劑，采用Philips SONOS 5500超聲儀，探頭頻率為12 MHz進行超聲心動圖檢查。以M型超聲心動圖進行測量各組大鼠左心室舒張末期內徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)、左心室收縮末期內徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短分數(left ventricular ejection fractional shortening，LVFS)。

2.3 ELISA法檢測各組大鼠血清BNP含量超聲心動圖檢測后，將大鼠腹主動脈取血，經離心后，取得血清學樣本。加適當稀釋的待檢樣品100 μL于包被的反應孔中，用封板膜封板后置37 ℃孵育，洗滌后于各孔中加入抗體100 μL，溫育洗滌后，在各孔加入酶結合物工作液100 μL，重復溫育洗滌，再于各孔加入TMB底物溶液100 μL，37 ℃避光反應20 min，待終止反應后，在酶標儀上450 nm處，檢測出各孔OD值。

2.4 HE染色檢測各組大鼠心肌細胞病理變化腹主動脈取血后，大鼠開胸，剝離并取出心臟組織，固定于4%組織固定液中，切片。依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min二甲苯Ⅱ 20 min無水乙醇Ⅰ 5 min無水乙醇Ⅱ 5 min 75%乙醇5 min，再將切片入蘇木素染液染5 min，入伊紅染液中染色5 min，脫水封片。隨后用顯微鏡鏡檢，并進行圖像采集分析。

2.5 WB法檢測各組大鼠心肌線粒體動力學及相關信號通路分子蛋白表達水平實驗二結束后，取各組大鼠心臟左心室部分組織，將組織用PBS洗滌后置于勻漿管中，勻漿后裂解組織，12 000×g離心10 min，收集上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。沸水水浴變性15 min后電泳、轉膜、封閉，稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，于脫色搖床上洗3次，將二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫孵育30 min。將PVDF膜的蛋白加入ECL溶液充分反應，1～2 min后曝光，將膠片掃描，photoshop整理去色，Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

3 結果

3.1 DOX大鼠一般情況變化實驗6周后，Control組大鼠體質量增長正常，DOX各組大鼠精神狀態變差，食欲減退，毛發脫落，體質量下降，活動緩慢，部分大鼠出現腹瀉。實驗后DOX各組體質量與對照組相比，均有所下降，差異有統計學意義，且DOX 3組比DOX1組和DOX 2組體質量下降更明顯，如Fig 1E所示。此外，DOX的累積劑量與大鼠的死亡率呈正相關，DOX 1組大鼠死亡率17%(n=10)，DOX 2組大鼠死亡率25%(n=9)，DOX 3組大鼠死亡率42%(n=7)，對照組無死亡。

3.2 DOX大鼠心臟結構及心功能改變為了評估DOX大鼠心臟結構及心功能變化，在實驗6周后，對大鼠進行超聲心動圖檢測。DOX各組大鼠與Control組相比，大鼠均出現左心室擴大，心功能降低(Fig 1A)，且差異有統計學意義；與DOX 1組相比，DOX 2組、DOX 3組LVIDd，LVIDs值升高，EF、FS值下降，差異有統計學意義；與DOX 2組相比，DOX 3組EF、FS值下降，差異有統計學意義(Fig 1B、C)。我們進一步檢測了心衰定量標志物BNP，結果表明，相比于Control組大鼠，DOX各組大鼠BNP均有所升高(Fig 1D,P<0.01)；與DOX 1組相比，DOX 2組、DOX 3組BNP值升高(Fig 1D,P<0.01)；與DOX 2組相比，DOX 3組BNP值升高(Fig 1D，P<0.01)。

3.3 DOX大鼠心肌病理變化為了明確大鼠心肌病理變化，取大鼠心臟組織進行HE染色。Control組大鼠心肌細胞排列有序，細胞結構規則，無細胞肥大、增生，無炎性浸潤；DOX各組大鼠心肌細胞排列松散，形態不規則，間質增生，心肌纖維染色不均，伴有肥大細胞和炎性細胞浸潤，且DOX 3組較DOX 1組、DOX 2組心肌細胞損傷更嚴重(Fig 2)。

3.4 DOX大鼠線粒體動力學及相關通路信號分子的變化 通過實驗一數據對比，選取了DOX 2組為最優劑量。設立Control組、DOX 2組、DOX 2+Mdivi-1組，進一步檢測心肌組織內心肌線粒體分裂蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)、線粒體融合蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)及相關信號通路蛋白(FUN14 domain containing 1，FUNDC1)(Fig 3A)。與Control組相比，DOX 2組及DOX 2+Mdivi-1組FUNDC1信號通路相關的線粒體分裂蛋白DRP1表達增強，融合蛋白OPA1表達降低；與DOX 2組相比，DOX 2+Mdivi-1組FUNDC1、DRP1蛋白表達量降低，OPA1表達增強，差異有統計學意義(Fig 3B)。4 討論

實驗的病理結果顯示，DOX具有明顯的心肌細胞損害作用，DOX各組大鼠表現為心功能障礙，且DOX導致的心衰程度與DOX累計劑量呈正相關，隨著DOX累計劑量的上升，大鼠的心衰發展及死亡率均有所上升。在進一步探討DOX心衰機制中發現，DOX導致大鼠心肌內DRP1、FUNDC1蛋白表達量增加、OPA1蛋白表達降低。說明一定劑量的DOX誘導慢性心衰發生，其機制可能與DRP1/FUNDC1介導的心肌線粒體發生過度分裂、減少線粒體融合有關。

既往研究表明，大鼠在腹腔注射DOX累計劑量達到12 ～18 mg·kg-1時，可發生CHF[12]。在實驗一中發現，大鼠腹腔注射DOX累積劑量達到12 mg·kg-1時，超聲心動圖顯示大鼠射血分數保留或下降，BNP含量上升；當累積劑量越大時，大鼠精神狀態更差，體質量降低明顯，部分伴有腹水發生，超聲心動圖顯示大鼠的LVIDd、LVIDs更高，LVEF、LVFS值更低。BNP是診斷心衰的重要標志物，在左心室超負荷狀態下，BNP分泌增高，并隨著疾病的嚴重程度而遞增，對于評估心衰的嚴重程度及預后具有重要價值。實驗結果證實，劑量的累積導致大鼠BNP進一步升高，心功能更差。考慮到DOX 1組存在極少數射血分數保留情況，DOX 2組死亡率小于DOX 3組，且DOX 2組同DOX 3組比較LVIDd與LVIDs差異無統計學意義，因此，選取了DOX 2組作為最優劑量進行實驗二。

Fig 1 Effect of DOX on cardiac structure,cardiac function and body weight of

Fig 2 The morphological changes of heart tissues in four groups(200×)

FUNDC1(FUN14 domain containing 1)是位于線粒體外膜的蛋白質，通過參與線粒體的融合及分裂，維持心臟功能，FUNDC1的缺失會導致心力衰竭[13]。在正常情況下，FUNDC1與位于線粒體內膜(IMM)上的線粒體融合蛋白：視神經萎縮蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)相互作用，為心肌細胞提供能量；而在應激條件下，FUNDC1能夠促進線粒體動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)易位至線粒體外膜(OMM)進而誘導線粒體分裂[14]。在實驗中發現，DOX誘導的大鼠發生心衰時，FUNDC1、DRP1蛋白表達量增強，而OPA1蛋白表達量下降。OPA1對線粒體嵴結構的控制發揮重要作用，能夠阻止細胞色素C的釋放，減少細胞凋亡發生[15]。OPA1的降低表明DOX導致心肌線粒體受損，心肌線粒體融合減少，能量供應降低，心肌細胞死亡風險增加。DRP1是線粒體分裂的關鍵樞紐，主要位于細胞質中[16]。在DOX誘發的大鼠心衰中，FUNDC1、DRP1蛋白表達量增強，表明DOX增強了線粒體的分裂，且兩蛋白趨勢相同提示DOX可能通過FUNDC1通路招募了DRP1蛋白。為了繼續驗證FUNDC1與DRP1蛋白的關聯性，我們使用了線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)。Mdivi-1作為Drp1的選擇性抑制劑，在DOX誘導的心臟毒性中具有保護作用[17]。結果表明，在聯用了Mdivi-1之后，DRP1、FUNDC1的蛋白均有所降低，OPA1蛋白表達增強。由此可見，DOX誘導的心衰可能與其通過DRP1/FUNDC1信號通路促進了線粒體過度分裂、減少了線粒體融合有關。但本實驗只對涉及的通路及機制做了初步探討，后續可通過基因敲除及檢測蛋白間相互作用，做進一步深入研究。

Fig 3 Effect of DOX on mitochondrial dynamics and

**P<0.01vsControl group;#P<0.05vsDOX 2 group;##P<0.01vsDOX 2 group