細菌內毒素光度法檢測能力驗證研究

杜 穎，陳 晨，蔡 彤，譚德講，高 華

(中國食品藥品檢定研究院化學藥品檢定所藥理室，北京 102629)

細菌內毒素是一種能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。注射用藥品中如果含有被污染的外源性內毒素，在臨床使用時，病人會出現發熱反應，嚴重時還會出現寒顫、惡心、甚至死亡等熱原反應。20世紀70年代，建立了使用鱟試劑檢測注射液中的細菌內毒素的檢查法——細菌內毒素檢查法。目前《中國藥典》2015年版中共有653個品種采用此方法檢驗，可見細菌內毒素檢查法是保證臨床用藥安全的重要手段之一，也是藥品常規檢測中的一項關鍵安全性指標。

實驗室能力驗證是通過實驗室間檢測結果的比對來確定實驗室能力的活動，包含能力驗證計劃、實驗室間比對計劃和測量審核等所有與能力驗證相關的活動。它是評價實驗室技術能力的重要技術方法之一，是判斷和監控實驗室能力的有效手段，也是實驗室內部質量控制方法的有效補充。同時，能力驗證也是維持認可機構間國際互認的基礎之一[1-2]。

細菌內毒素檢查法的原理和操作[3]雖然簡單，但是有很多因素會影響實驗結果，如鱟試劑靈敏度、實驗環境、實驗人員的操作等。為考察全國藥檢系統實驗室細菌內毒素檢測能力的基本情況，2020年中國食品藥品檢定研究院(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,NIFDC)按照實驗室認可和實驗室資質認可的有關要求，組織實施了細菌內毒素光度法檢測能力驗證計劃[4]，編號為NIFDC-PT-267。希望通過此次能力驗證這一外部質控手段，在全國范圍內評價實驗室細菌內毒素光度法檢測能力，并推動內毒素檢測能力和技術水平的進一步提高。

本文概述了能力驗證項目NIFDC-PT-267的實施情況，對檢測數據進行了技術分析，以幫助各實驗室對自身的細菌內毒素檢測能力有更全面的認識并改善提高，同時也為管理部門利用實驗室資源提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 待測樣品制備本次能力驗證待測樣品為細菌內毒素白色凍干粉末，2 mL玻璃安瓿裝。每個參加實驗室發放1支待測樣品。

1.2 待測樣品均勻性和穩定性考察隨機抽取能力驗證待測樣品20支，按照CNAS-GL003：2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》[5]規定，采用《中國藥典》2015年版四部通則1143細菌內毒素檢查法中的光度測定法對樣品進行檢測。采用單因素方差分析檢驗樣品的均勻性，結果P>0.05。表明本次能力驗證待測樣品支間差異無統計學意義，均勻性良好。

細菌內毒素具有良好的穩定性，根據多批細菌內毒素標準品的檢測數據可以得出，穩定期均在5年以上。

1.3 待測樣品檢測方法與結果統計

1.3.1檢測方法 本次能力驗證計劃要求實驗室按照《中國藥典》2015年版四部(通則1143)細菌內毒素檢查法[3]-方法2 光度測定法中的任意一種方法進行檢測。

1.3.2結果統計方法 本計劃參照CNAS-GL002：2018《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》[6]及ISO 13528[7]，采用參加者的公議值，即本次所有參加實驗室的有效檢測結果的穩健平均值作為該輪次能力驗證待測樣品內毒素含量的指定值X。統計分析使用統計軟件JMP13，進行穩健均值及穩健標準差的計算，該計算是使用Huber M估計以不受離群值影響的方式計算的穩健均值。

因影響細菌內毒素檢測結果準確性的因素有很多，如溶解、稀釋、加樣過程中的容量誤差和操作誤差、使用儀器的儀器偏差等。《中國藥典》通則1143中規定，光度檢測法中檢測結果回收率在50%～200%之間即為符合要求，該規定的誤差范圍已考慮涵蓋各種因素導致的誤差范圍。因此本次能力驗證對檢測結果×的判定，以樣品指定值X的50%～200%范圍為判定標準。

1.3.3統計量的能力評定 將檢測結果取對數(由于生物測定的數據理論上是其對數值呈正態分布，故本次能力驗證先需對檢測結果取對數(lg)后，再對數值進行統計分析)，而后將數值用統計軟件JMP13處理分析，所得穩健均值為1.076 214 3，取反對數后數值為11 918.3 EU·L-1，即1.2×104EU·L-1。故使用1.2×104EU·L-1作為本次能力驗證樣品內毒素含量指定值X，應該在其的50%～200%的范圍內，即6.0×103EU·L-1～2.4×104EU·L-1。

1.3.4結果判定原則 當(6.0×103EU·L-1≤x≤2.4×104EU·L-1)時，結果為“滿意”；當(x<6.0×103EU·L-1或x>2.4×104EU·L-1)時，結果為“不滿意”。

2 實驗室參加情況

本次能力驗證共有51家實驗室報名參加，其中代碼為417和718的實驗室，在收到待測樣品后提出退出。本次能力驗證發放樣品51份，收到49個有效數據。參加實驗室分布于全國22個省(自治區)、直轄市，主要包括藥品化妝品醫療器械(兩品一械)檢驗檢測系統實驗室、企業QC實驗室和其他實驗室。其中江蘇省11家實驗室，廣東省5家實驗室，浙江省和北京市各4家實驗室，山東省3家實驗室，甘肅省、河南省、吉林省、四川省和上海市各2家實驗室，安徽省、福建省、海南省、河北省、黑龍江省、江西省、遼寧省、山西省、陜西省、新疆維吾爾自治區、天津市和重慶市各1家實驗室。

3 結果

3.1 能力驗證總體統計量本次能力驗證檢測方法為光度測定法，將49個數據按作業指導書規定先取2位有效數字后，再取對數進行統計分析，結果匯總統計量見Tab 1。

Tab 1 Summary for statistics of test result

3.2 實驗室內毒素含量檢測結果及評定參加實驗室檢測結果及評定見Tab 2。

Tab 2 Test result and evaluation of laboratories

在49家參加實驗室中，被評定為“滿意”的共有45家，滿意比率為91.8%；被評定為“不滿意”的實驗室有4家(實驗室代碼分別為274，604，715和915)，不滿意比率為8.2%。

3.3 參加實驗室檢測結果分布圖見Fig 1。

4 討論[8-9]

4.1 不同實驗室類型的比較參加本次能力驗證的49家實驗室中，兩品一械檢驗檢測系統實驗室34家，占總參加實驗室的70%，主要是各省、市及地方的食品藥品檢定機構。其中32家結果為滿意，2家結果為不滿意；企業QC實驗室9家，占總參加實驗室的18%，結果全部為滿意；其他實驗室6家，占總參加實驗室的12%，其中4家結果為滿意，2家結果為不滿意。見Tab 3。

本次能力驗證，與2017年細菌內毒素能力驗證參加實驗室數量相比較，雖然總實驗室數量下降了64%(2018年參加實驗室共136家，其中凝膠法113家，定量法23家)，但定量法實驗室數量卻增加了53%。表明隨著實驗技術的發展與提升，國內實驗室已逐步提升自身的檢測水平，在日常檢測樣品時，除了使用操作方便、快捷，成本低的凝膠法以外，也開始使用可以定量，且準確性高的定量法。此外，采用定量法檢測的實驗室，多數還是兩品一械檢驗檢測系統實驗室，在企業及其他實驗室使用則較少。

4.2 檢測方法的選擇[10-12]細菌內毒素光度測定法分為濁度法和顯色基質法。根據檢測原理不同，濁度法和顯色基質法還可分為動態濁度法、終點濁度法、動態顯色法和終點顯色法。本次能力驗證49個參加實驗室，有36家使用的是濁度法(全部是動態濁度法)，占總數的73.5%；13家使用顯色法(12家是動態顯色法，1家是終點顯色法)，占總數的26.5%。濁度法檢測的數據中，35家實驗室為“滿意”結果，1家實驗室為“不滿意”結果。顯色法檢測的數據中，10家實驗室為“滿意”結果，3家為“不滿意”結果。

對濁度法(36家)和顯色基質法(13家)檢測數據進行比較分析。首先進行異常值檢測，統計結果顯示，實驗室代碼為274、604、715和915,4個檢測結果為異常值，見Fig 2。剔除該4個異常值后，將二者檢測結果再進行單因素方差分析，統計結果為差異無顯著性(P>0.05)，表明兩種檢測方法的檢測結果差異無顯著性。

4.3 不滿意結果實驗室分析[10-11]本次能力驗證有4家實驗室的檢測結果被評為“不滿意”，對這4家實驗室的檢測結果進行分析：(1)代碼274：是本次能力驗證中唯一一家使用終點顯色法的實驗室。其標準溶液的濃度選擇為1 000、500、250和100 EU·L-14個點，所對應的吸光度值分別為1.586、1.051、0.742、0.412。其能力驗證樣品采用的是2倍稀釋液，所得吸光度值為3.032，該值已經高于標準曲線最高濃度點的吸光度值。表明樣品內毒素含量未落在標準曲線范圍內，故使用該標準曲線外推法計算出來的數值，是不準確的。從而導致該實驗室提供的檢測結果4.2×103EU·L-1低于本次能力驗證的判定下限(<6.0×103EU·L-1)，因此，評定其為“不滿意”；建議實驗室應調整樣品稀釋倍數或者標準曲線范圍，使樣品吸光度值落在標準曲線范圍內，以保證檢測結果的準確可靠。(2)代碼為604、715和915：此3家實驗室提供的《細菌內毒素光度法檢測實驗結果記錄》中，實驗操作符合《中國藥典》通則1143中的規定，但其檢測的結果未在本次能力驗證指定值X的50%～200%范圍內，故評定為“不滿意”。建議實驗室查找內部原因，以保證日后樣品檢測結果的準確可靠。

Tab 3 Evaluation of laboratory type and test results

Fig 1 Diagram of proficiency testing results of photometric method of bacterial endotoxin test

Fig 2 Outlier detection for test results

4.4 本次能力驗證發現的問題及建議

4.4.1未在檢驗樣品時制備標準曲線[13-15]《中國藥典》通則1143中明確規定，光度檢查法需按“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測，使用系列溶液C(用于制備標準曲線的標準內毒素溶液)生成的標準曲線來計算溶液A(稀釋倍數不超過MVD的供試品溶液)的每一個平行管的內毒素濃度。即檢測樣品時，要同時制備一條不少于3個濃度點的標準曲線，用該標準曲線來計算所測樣品的內毒素含量。

本次能力驗證中，有個別實驗室在檢測能力驗證樣品時，僅做了陰性對照、樣品溶液和樣品陽性對照溶液，而標準曲線則是使用保存在軟件中的一條標準曲線來計算樣品內毒素含量。由于光度測定法測定的靈敏性高，與凝膠法相比，檢測結果的準確性更易受到實驗環境、操作、儀器等因素的影響，故為避免系統誤差，標準曲線和樣品應在相同的實驗條件下一起進行制備和檢測。因此，建議實驗室應按照《中國藥典》通則1143中的規定，在每次實驗時均需要制備細菌內毒素標準曲線，才能保證樣品檢測結果的準確性和可靠性。

4.4.2未做標準曲線可靠性驗證[14]《中國藥典》通則1143中明確規定：當使用新批號的鱟試劑或試驗室條件有任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。可見，標準曲線可靠性驗證是保證實驗室檢測結果準確可靠的前提條件。

本次能力驗證中，有個別實驗室未做標準曲線可靠性驗證。因此，建議實驗室在使用新批號的鱟試劑或試驗室條件有任何可能會影響檢驗結果的改變時，應按《中國藥典》通則1143要求先進行標準曲線可靠性驗證實驗，實驗符合要求后，再使用該批鱟試劑進行樣品的內毒素檢測。

4.4.3樣品反應時間未落到標準曲線上時的情況處理 在本次能力驗證中，發現有個別實驗室檢測樣品的反應時間或吸光度值落在標準曲線外(樣品反應時間大于標準曲線最低濃度點反應時間和樣品反應時間小于標準曲線最高濃度點反應時間)，實驗室的檢測結果為儀器軟件使用標準曲線外推法計算出來的數值，不夠精確。

《中國藥典》通則1143中，雖未明確規定樣品檢測反應時間大于或小于標準曲線最低或最高濃度點時，樣品內毒素含量應如何計算。但從科學角度出發，當樣品反應時間未落在標準曲線范圍內時，結果應按如下方式表示：(1)當樣品反應時間小于標準曲線最高濃度點的反應時間或樣品的吸光度大于最高濃度點的吸光度時，內毒素含量應為樣品稀釋倍數乘以標準曲線最高濃度點所得的數值，結果表述為樣品內毒素含量大于XX EU·L-1；(2)當樣品反應時間大于標準曲線最低濃度點反應時間或樣品的吸光度小于最低點的吸光度時，表明樣品內毒素含量低于標準曲線最低濃度點，其內毒素含量應為樣品稀釋倍數乘以標準曲線最低濃度點所得的數值，結果為樣品內毒素含量小于XX EU·L-1。

若希望準確測得樣品中的內毒素含量，應調整樣品稀釋倍數或標準曲線濃度范圍，重新檢測，使樣品的反應時間或吸光度值落在標準曲線范圍內。這樣操作，所檢測的實驗結果，才會更加準確與可靠。