人臍帶間充質干細胞來源外泌體增強心臟肌成纖維細胞血管形成作用

趙媛媛，李潔潔，費蘇燕，陳 忱，徐 鑫，王 韌，朱 偉

(江蘇大學 1.醫學院、2.附屬醫院,江蘇 鎮江 212013)

近年來，外泌體(exosomes)作為一種新型生物材料或藥物載體在腫瘤和組織損傷修復等領域應用前景令人期待[1]。心肌缺氧損傷后增強血管形成，恢復血供對于炎癥清除及損傷修復至關重要，研究表明，干細胞及其exosomes可通過促進血管形成發揮心肌保護作用[2 -3]。心臟成纖維細胞在非心肌細胞中占比最大，在心肌損傷后各個階段均發揮重要作用，近年來有研究者關注到心臟成纖維細胞的血管形成作用。心肌梗死后修復階段，成纖維細胞轉分化為高表達α-SMA的肌成纖維細胞，產生抗炎和促血管生成因子，研究者發現，心肌梗死后d3心臟成纖維細胞能夠促紅細胞生成和促血管生成[4 -5]。此外，還有研究者從小鼠心臟中分離出兩種成纖維細胞亞型，并證實FSP1陽性成纖維細胞亞群具有突出的促血管生成作用[6]。成纖維細胞去分化為中間型CD34+祖細胞，可以產生內皮細胞和成紅細胞，進而產生功能性血管或紅細胞，并挽救缺血組織[7]。

前期研究發現，人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC)來源exosomes利于組織損傷修復，促進炎癥條件下成纖維細胞轉分化[8-9]。HucMSC-exosomes能否通過增加心臟肌成纖維細胞分泌血管形成相關因子從而促進血管形成還未可知。本研究采用一系列實驗檢測exosomes作用后心臟肌成纖維細胞對內皮細胞增殖、遷移和小管形成能力的影響及可能機制。這將為探索心肌損傷修復相關機制提供實驗依據，為干細胞或生物材料治療心肌損傷相關研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料臍帶組織標本取自江蘇大學附屬醫院婦產科，標本收集及使用遵循知情同意原則，并通過倫理委員會批準。SD大鼠(1～3日齡)取自江蘇大學實驗動物中心，相關動物實驗經江蘇大學實驗動物中心批準，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0053。人臍靜脈內皮細胞HUVEC來源于ATCC細胞庫。

1.2 主要儀器流式細胞儀(Beckman Coulter公司，美國)；高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；透射電子顯微鏡(日本電子)；Nanosight納米顆粒分析儀(Malvern Panalytical公司，英國)；紫外/核酸蛋白檢測儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；Western blot垂直電泳儀(Bio-Rad公司，美國)；ImageQuant LAS 4000 mini 化學發光成像儀(GE公司，美國)；實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)；熒光顯微鏡(Olympus Corporation公司，日本)；光學顯微鏡(Nikon公司，日本)；酶標儀(BioTek 公司，美國)。

1.3 主要試劑L-DMEM (Gibco公司，美國，01-051-1A)；H-DMEM(Gibco公司，美國，06-1055-57-1A)；α-MEM培養基(Gibco公司，美國，01-042-1)；胎牛血清FBS(Biological Industries公司，以色列，04-001-1A)；HBSS平衡鹽溶液(Gibco公司，美國，14170112)；胰酶(Worthington公司，美國，LS003708)；胰酶抑制劑(Worthington公司，美國，LS003570)；Ⅱ型膠原酶(Worthington公司，美國，LS004174)；CCK8試劑(上海碧云天生物技術有限公司，中國，C0039)；基質膠(Corning公司，美國，356234)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，中國，CW0014S)；RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國，15596018)；逆轉錄試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，中國，CW2569M)；Transwell培養板(Corning 公司，美國，3422)；α-SMA(Cell Signaling Technology 公司，美國，19245T)；CD81(Cell Signaling Technology公司，美國，52892S)；calnexin(Cell Signaling Technology公司，美國，2679T)；GAPDH(Cell Signaling Technology公司，美國，51332S)；VEGF-A(武漢博士德生物工程有限公司，中國，A00045)；ICG-001(上海碧云天生物技術有限公司，中國，SF6827)；β-actin(Cell Signaling Technology 公司，美國，4970S)；熒光二抗(Cell Signaling Technology 公司，美國，4412S)。

1.4 方法

1.4.1HucMSC及其來源exosomes分離及鑒定 依據先前實驗方法[8-9]，培養hucMSC，采用流式細胞術檢測其相關表面標記 CD19、CD34、CD45、CD29、CD105 和CD90。收集hucMSC無exosomes血清培養基，分別經4 ℃，300g離心20 min，800g離心20 min，2 000g離心20 min，1×104g離心30 min以去掉細胞及細胞碎片，使用超速離心法提取exosomes。Exosomes經透射電子顯微鏡記錄其形態，使用Nanosight納米顆粒分析儀檢測exosomes粒徑分布情況。

向hucMSC或exosomes中加入蛋白裂解液，低溫裂解提取相應蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后加入5×loading buffer充分混勻，沸水浴10 min備用。制備聚丙烯酰胺凝膠，以每孔150 μg蛋白量上樣，60 V恒壓進行電泳，當樣品到達分離膠時行100 V恒壓電泳，電泳結束后，以350 mA恒流冰上轉膜120 min，隨后將PVDF膜置于脫脂牛奶中封閉1 h，4 ℃過夜孵育相應一抗CD81、calnexin和GAPDH，1× TBST洗滌，37 ℃孵育辣根過氧化物酶標記相應二抗1 h，1× TBST洗滌，最后加入適量顯色底物，采用ImageQuant LAS 4000 mini化學發光成像儀成像。

1.4.2心臟肌成纖維細胞分離培養及鑒定

1.4.2.1 分離培養心臟肌成纖維細胞 選取1～3日齡SD大鼠，麻醉后無菌環境下取出心臟，HBSS平衡鹽溶液洗滌3遍，將心肌組織剪碎至1 mm3大小，加入胰酶輕柔吹打混勻，4 ℃過夜。次日，加入胰酶抑制劑及II型膠原酶，37 ℃恒溫消化，當大部分組織塊消失時用H-DMEM培養液(含10% FBS)終止消化，40 μm濾網過濾后將濾過液轉移至新離心管中，800g離心5 min，棄上清，H-DMEM培養液(含10% FBS)重懸細胞并接種于細胞培養板或培養皿中，培養90 min后棄掉未貼壁細胞，更換α-MEM培養基(含10% FBS)，繼續于37 ℃，5 % CO2細胞培養箱中培養備用。

1.4.2.2 免疫熒光細胞化學染色 預先將細胞爬片置于培養皿中，接種生長狀態良好原代肌成纖維細胞，37 ℃，5 % CO2細胞培養箱培養。待細胞達到合適密度時，行4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，0.1% Triton X-100作用，5% BSA封閉，4 ℃過夜孵育一抗α-SMA，37 ℃孵育相應熒光二抗，Hoechst染色等步驟，最后使用熒光顯微鏡拍照。

1.4.3收集對照組和exosomes作用組心臟肌成纖維細胞及其培養基 當接種于細胞培養皿中的原代肌成纖維細胞密度達到60%～70%時，對照組加入α-MEM培養基(含10% FBS)，exosomes作用組加入α-MEM培養基(含10% FBS)和hucMSC來源exosomes(200 mg·L-1)，37 ℃，5% CO2培養24 h，更換新鮮培養基繼續培養24 h，收集細胞及細胞培養基。收集細胞用于檢測心臟肌成纖維細胞VEGF-A水平，此外β-catenin信號通路與促進血管形成密切相關，然而此實驗條件下VEGF-A表達是否與β-catenin信號相關還不清楚，因此，在加入exosomes同時使用β-catenin/TCF 介導的轉錄抑制劑ICG101(10 μmol·L-1)后，采用Western blot檢測VEGF-A表達水平。用對照組和exosomes作用組心臟肌成纖維細胞培養基預處理內皮細胞24 h，檢測細胞增殖、遷移及小管形成能力。

1.4.4CCK-8細胞增殖實驗 將預處理后的內皮細胞接種于96孔板，到達24、48和72 h時，加入CCK-8試劑，2 h后，用酶標儀測定450 nm波長吸光度值。

1.4.5Transwell細胞遷移實驗 當預處理后的血管內皮細胞細胞密度達到約80%時，用無血清 α-MEM培養基重懸細胞，取200 μL細胞懸液加入上室，下室加入α-MEM培養基(含10 % FBS)，37 ℃，5 % CO2培養8 h，取出Transwell小室，PBS輕柔清洗兩遍，用棉簽輕輕擦去未遷移細胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，0.1%結晶紫染色液染色5 min，PBS清洗3次，干燥后于顯微鏡下拍照。

1.4.6細胞劃痕實驗 預先在6孔板外底部畫3條標記線，接種預處理的血管內皮細胞，37 ℃，5% CO2培養，待細胞幾乎鋪滿板底時，用10 μL無菌吸頭在培養板內底部垂直于預畫標記線劃3條痕跡，PBS清洗2遍，分別加入α-MEM培養基(含10% FBS)，使用倒置顯微鏡拍照起始劃痕間隙(記為0 h)，隨后分別在6 h和12 h再進行拍照記錄。

1.4.7小管形成實驗 預先加入50 μL基質膠于96孔細胞培養板中(冰上操作)，37 ℃靜置使基質膠凝固，接種預處理后的血管內皮細胞，分別加入α-MEM培養基(含10% FBS)，37 ℃，5% CO2培養12 h，使用倒置顯微鏡對內皮細胞成管情況拍照記錄。

1.4.8細胞總RNA提取、逆轉錄及實時熒光定量PCR 收集對照組及exosomes作用組心臟肌成纖維細胞，RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA濃度，依據逆轉錄試劑盒說明書步驟逆轉錄。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測VEGF-A相對表達量，其中β-actin作為內參，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

1.4.9細胞總蛋白提取及Western blot 參照上述hucMSC來源exosomes鑒定方法學中細胞總蛋白提取及Western blot方法，加入適量細胞裂解液至對照組及exosomes作用組心臟肌成纖維細胞，經細胞裂解、離心、BCA法檢測蛋白濃度以及加入5×loading buffer沸水浴等步驟后，制備聚丙烯酰胺凝膠，按照每孔蛋白量150 μg上樣，經電泳、轉膜、封閉后，4 ℃過夜孵育相應一抗VEGF-A和β-actin，洗膜后37 ℃孵育辣根過氧化物酶標記相應二抗，加入相應顯色液，采用ImageQuant LAS 4000 mini化學發光成像儀成像。

2 結果

2.1 HucMSC形態及exosomes鑒定顯微鏡下可見hucMSC呈長梭形，漩渦樣生長，具有典型的間充質干細胞形態(Fig 1A)。流式細胞術檢測hucMSC相關表面標記，結果顯示其不表達CD19、CD34和CD45，而高表達CD29、CD105和CD90，與間充質干細胞特性相符(Fig 1B)。經透射電子顯微鏡和Nanosight納米顆粒分析儀檢測發現，hucMSC來源exosomes粒徑約100～200 nm(Fig 1C，D)。Western blot結果顯示，相較于hucMSC，其exosomes高表達跨膜蛋白CD81，不表達內質網的特異性分子Calnexin，這些均與exosomes特征相符(Fig 1E)。

2.2 大鼠心臟肌成纖維細胞鑒定分離培養大鼠心臟成纖維細胞，由Fig 2免疫熒光細胞化學染色發現，細胞高表達α-SMA，提示細胞已被激活處于轉分化階段，為心臟肌成纖維細胞。

2.3 Exosomes作用后心臟肌成纖維細胞促進內皮細胞增殖能力與對照組相比，采用hucMSC來源exosomes作用心臟肌成纖維細胞后培養基預先處理內皮細胞，CCK-8細胞增殖實驗檢測發現，在72 h時間點，exosomes作用組與對照組內皮細胞450 nm吸光度值差異具有統計學意義(Fig 3)，表明exosomes作用后心臟肌成纖維細胞可促進內皮細胞增殖。

2.4 Exosomes作用后心臟肌成纖維細胞促進內皮細胞遷移Transwell細胞遷移實驗結果發現，exosomes作用組遷移至小室另一側內皮細胞數量明顯多于對照組(Fig 4A)。此外，在12 h記錄點，exosomes作用組內皮細胞中間劃痕區已被填滿，而對照組仍留有一定距離，提示與對照組相比，exosomes 作用組的HUVEC遷移能力明顯增加(Fig 4B)。

2.5 Exosomes作用后心臟肌成纖維細胞使內皮細胞成管能力增強如Fig 5所示，exosomes作用組內皮細胞形成小管管腔數量以及節點數量均比對照組明顯增加。提示exosomes作用后心臟肌成纖維細胞能夠增強內皮細胞成管能力。

Fig 1 Characterization of hucMSC and hucMSC-exosomes

Fig 2 Expression of α-SMA in cardiac myofibroblasts detected

Fig 3 The proliferation ability of HUVECs enhanced by cardiac

The proliferation ability of HUVECs was detected by CCK-8 assay.*P<0.05vscontrol group.

2.6 HucMSC來源exosomes通過β-catenin信號促進心臟肌成纖維細胞表達VEGF-AVEGF-A是血管形成所需重要細胞因子，hucMSC來源exosomes作用心臟肌成纖維細胞后收集細胞，熒光定量PCR實驗(Fig 6A)與Western blot檢測結果(Fig 6B)發現，與對照組相比，exosomes作用組VEGF-A表達水平升高。加入β-catenin/TCF 介導的轉錄抑制劑后，VEGF-A表達水平降低(Fig 6C)。

3 討論

Exosomes是細胞內多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到細胞外，內含蛋白質或RNA等多種生物大分子的一種納米顆粒，既含有來源細胞的生物分子，還具有來源廣泛、安全性高和易于保存運輸等優點，在藥物遞送、組織損傷修復等方面有很好的應用前景。其中在心肌組織損傷修復相關研究中，心臟成纖維細胞作為心臟組織中重要的細胞類型，近年來主要關注點在心肌纖維化及心臟重塑方面[10 -11]，間充質干細胞來源exosomes能夠抑制心肌纖維化的研究也有報道[12]。然而，有研究表明在心肌損傷后增殖階段，心臟成纖維細胞可釋放促血管形成相關因子[4]。成纖維細胞的促血管形成作用在心肌損傷修復過程中值得關注，本研究通過內皮細胞管形成等一系列實驗發現，經hucMSC來源exosomes作用后的心臟肌成纖維細胞，可以促進內皮細胞增殖、遷移和小管形成。VEGF-A是促進血管形成的重要因子，一方面exosomes能夠富集VEGF-A進而促進血管形成[13]，另一方面主要是exosomes通過作用于血管內皮細胞增加VEGF-A的表達，促進血管形成，進而促進損傷修復[14]。此外β-catenin信號通路與促進血管形成密切相關，進一步檢測發現exosomes作用后的心臟肌成纖維細胞VEGF-A表達增加，并與β-catenin信號相關。

據研究報道成纖維細胞促進血管形成相關機制可能涉及成纖維細胞間質內皮細胞轉化，成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞進而分泌促血管形成因子。Ke等[15]報道人內皮源性exosomes通過促進間質內皮細胞轉化和降低高遷移率族蛋白HMGB1表達，增加心臟成纖維細胞的增殖和血管生成。另有研究發現成纖維細胞GATA-4和GATA-6促進了壓力超負荷誘導的心肌肥厚的適應性重塑。心源性轉錄因子GATA-4和GATA-6在心臟成纖維細胞中發揮了新的作用，這兩種蛋白質通過細胞間的協同作用，促進心肌血管形成和心臟功能[16]。Li等[17]證明了干細胞來源的細胞外囊泡攜帶miR-486-5p 通過成纖維細胞 MMP19-VEGF-A信號促進心臟血管新生的關鍵作用。本研究結果顯示，hucMSC來源exosomes增加心臟肌成纖維細胞促血管形成能力，心臟肌成纖維細胞VEGF-A表達增加。然而更深入的細胞分子機制還需進一步探究，例如exosomes內哪種分子起關鍵作用、下游關鍵信號軸研究、成纖維細胞是否涉及間質內皮轉化機制，這項研究可能為工程化exosomes應用提供有力的實驗基礎。

Fig 4 The migration ability of HUVECs enhanced by cardiac myofibroblasts pre-treated by hucMSC-exosomes

Fig 5 The tube forming ability of HUVECs enhanced by cardiac myofibroblasts pre-treated by n=3 )

Fig 6 Expression of VEGF-A in cardiac myofibroblasts enhanced by HucMSC-exosomes via β-catenin n=3 )