雷公藤紅素靶向抑制STAT3抗結(jié)直腸癌的機(jī)制

范若蘭，陳海蘭，賴 斌，李志利，徐 偉，嚴(yán)國鴻,3，許少華，樊志敏

(1．福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點實驗室，福建 福州 350122；2．南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210022；3．福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004)

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是一種常見的消化道腫瘤，發(fā)病率在消化道腫瘤中位居第三，也是最常見的惡性腫瘤死亡原因之一[1]。手術(shù)是治療惡性腫瘤的主要手段之一，治療時在術(shù)前及術(shù)后會采用輔助化療以及放療手段來提高治愈效果[2]，但治療后副反應(yīng)較多；并且近些年來化療藥物頻頻出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，而大量研究表明，中藥的多種活性成分能夠?qū)鼓[瘤增殖以及多重耐藥，這使得研究者將目標(biāo)轉(zhuǎn)移至中藥提取物及活性單體的開發(fā)和利用[3]，開發(fā)安全高效的抗腫瘤天然藥物成為一大熱點。

雷公藤紅素(celastrol，CEL)是衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiamWilfordilHook.f.)的主要活性成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗肥胖等多種藥理活性[4-5]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中均有異常活性，腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的失調(diào)能夠?qū)е铝姿峄疭TAT3持續(xù)表達(dá)[6]，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖；IL-6通過其下游轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3在炎癥和癌變中發(fā)揮作用，能夠刺激癌細(xì)胞增殖和遷移[7]；而且IL-6、STAT3在結(jié)腸癌組織中均有較高的表達(dá)，JAK2/STAT3信號通路的過度活化與結(jié)腸癌有著密切關(guān)系[8]。此前有研究表明，CEL能夠下調(diào)磷酸化STAT3水平抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖[9]，而在最新研究中其通過靶向STAT3來抑制AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞重塑[10]。以上研究提示我們，CEL可能主要通過靶向抑制STAT3發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用。因此，本文重點探討了CEL對人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞中STAT3以及上下游相關(guān)基因的作用，測定其與人源STAT3重組蛋白的親和力，并在患者來源的結(jié)直腸腫瘤類器官(colorectal cancer organoid，CCO)模型中做進(jìn)一步抗癌活性驗證，為開發(fā)潛在的抗癌藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥雷公藤紅素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111946-201501)。

1.2 細(xì)胞株人肺癌細(xì)胞(A549)，人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)，人肝癌細(xì)胞(HepG2)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3 人體樣本4例結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本均來自于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院肛腸中心未接受治療的成年手術(shù)患者，所有實驗均經(jīng)南京市中醫(yī)院倫理委員會審查和批準(zhǔn)(KY2021134)，所有樣本的病理分析均在南京市中醫(yī)院病理科進(jìn)行。

1.4 主要試劑磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone，AF29496678)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，2120734)；DMEM/高糖培養(yǎng)基(HyClone，AF29498408)；RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone，AF29584257)；胎牛血清(Gibco，2148200RP)；二甲基亞砜(DMSO、Sigma，WXBD2695V)；CCK-8(美倫生物技術(shù)有限公司，MA0218-1)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，P0010)；β-actin(Mouse、SANTA)；STAT3(Rabbit、CST)；p-STAT3(Rabbit、CST)；JAK2(Rabbit、abcam)；p-JAK2(Rabbit、abcam)；Survivin(Rabbit、abcam)；MCL-1(Rabbit、abcam)；rhSTAT3蛋白(武漢華美生物工程有限公司，DA04741)；CM5芯片、HBS-EP緩沖液(10×)、醋酸鈉緩沖液(10 mmol·L-1)、再生試劑盒均購自GE Healthcare；Recombinant Human IL-6、R-spondin-1重組蛋白、Noggin重組蛋白和EGF重組蛋白均購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；ECL超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(UE、HS1023)；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天，C1052)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(美倫生物，貨號：MA0220-2，批號：Jan-8G)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，C113300500BT)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液(1 mmol·L-1，Gibco，15630080)；谷氨酰胺(200 mmol·L-1，Gibco，A2916801)；細(xì)胞培養(yǎng)添加劑N2(1×，Gibco，17502-048)；細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27(50×，Gibco，12587-010)；N-乙酰半胱氨酸(1 mmol·L-1,MCE，HY-B0215)；煙酰胺(10 mmol·L-1，MCE，HY-B0150)；轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)抑制劑A83-01(MCE，909910-43-6)；p38抑制劑SB-202190(MCE，HY-10295)；rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(rho-associated coiled-coil forming kinase，ROCK)抑制劑Y-27632(MCE，HY-10071)；TrypLETM Express 酶(Gibco，12604013)；基質(zhì)膠(Corning，356231)；青霉素-鏈霉素(10 000 kU·L-1，Gibco，15140163)。

1.5 儀器Biacore T200(GE Healthcare，28975001)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，ChemiDocXRS+)；多功能酶標(biāo)儀(TECAN，Infinite M200 Pro)；倒置生物顯微鏡(motic as2000)；數(shù)碼相機(jī)(moticam 2506)；流式細(xì)胞儀(Agilent Technologies，NovoCyte 3000)。

2 方法

2.1 雷公藤紅素溶液的配制精密稱取雷公藤紅素1.0 mg溶解于DMSO中配制成10 mmol·L-1的儲存液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)于含10%滅菌胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和人肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%滅菌胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.3 體外抗增殖活性檢測采用CCK-8法檢測不同濃度下的(0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μmol·L-1)CEL對3種腫瘤細(xì)胞(HepG2、HCT-116、A549)的毒性，取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至5×107L-1，以100 μL/孔接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，加入不同濃度的CEL繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2孵育1.5 h，450 nm處測吸光度(OD)值。細(xì)胞抑制率/%=(A對照-A給藥)/(A對照-A空白)×100%。

2.4 Western blot檢測p-JAK2、p-STAT3、Survivin、MCL-1蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至1×109L-1后接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長匯合達(dá)90%時，分別加入不同濃度的CEL，給藥6 h后IL-6(25 μg·L-1)刺激30 min；提取細(xì)胞總蛋白，利用12% SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)分離蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h，一抗稀釋液中4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；然后轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液中室溫孵育2 h，均勻滴加ECL化學(xué)發(fā)光顯影液，在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行檢測。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期

2.5.1細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞接種于6孔板，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去上清，更換為含不同濃度的CEL培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞沉淀,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清，加入1× Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×109L-1，吸取100 μL細(xì)胞懸液分裝至新管中，分別加入碘化丙啶染色液(PI)和Annexin V-FITC進(jìn)行染色，室溫避光孵育15 min，加入1×Binding Buffer工作液，混勻后利用流式細(xì)胞儀在488 nm下進(jìn)行檢測，利用NovoExpress軟件分析，繪制雙色散點圖。

2.5.2細(xì)胞周期 培養(yǎng)及給藥方式同“2.5.1”，離心收集細(xì)胞沉淀后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇吹打混勻，于4 ℃固定12 h后，1 000 r·min-1離心3 min，加入PI，37 ℃避光孵育30 min，利用流式細(xì)胞儀在488 nm處測量熒光強(qiáng)度，利用NovoExpress軟件分析結(jié)果。

2.6 Biacore試驗

2.6.1預(yù)富集試驗 將500 mg·L-1的rhSTAT3蛋白與不同pH的醋酸鈉緩沖液(10 mmol·L-1，4.5、5.0、5.5)混勻配置成rhSTAT3蛋白終濃度為10 mg·L-1，分別放置于無蓋的EP管中，取無蓋的EP管加入50 mmol·L-1的NaOH，用于芯片再生；將不同pH(4.5、5.0、5.5)醋酸鈉緩沖液配置的蛋白溶液進(jìn)樣到CM5傳感芯片上，觀察其與芯片的結(jié)合曲線，根據(jù)響應(yīng)值RU，選擇最適的偶聯(lián)條件。

理論偶聯(lián)量計算公式：RMAX=(MW analyte/MW ligand)×RL×Sm，式中MW ligand指蛋白將STAT3的分子量為90.1 ku，MW analyte為分析物的分子量為450，Sm為化學(xué)計量比為1。

2.6.2配體偶聯(lián)實驗 根據(jù)預(yù)富集試驗選擇最佳pH條件為5.5，取4 μL STAT3蛋白與196 μL醋酸鈉緩沖液混合于無蓋EP管中，另取100 μL NHS(N-羥基丁二酰亞)、140 μL乙醇胺于無蓋EP管中，對CM5傳感芯片表面未被蛋白結(jié)合的區(qū)域進(jìn)行封閉，平衡至室溫25 ℃左右，將無蓋EP管放在樣品架上，設(shè)定流速為10 μL·min-1，時間為420 s，計算得到STAT3蛋白與芯片的結(jié)合值為14 937 RU。

2.6.3解離平衡常數(shù)的測定 將配制好的雷公藤紅素母液分別用含有5% DMSO的PBS稀釋成250、125、62.5、31.2、15.63、7.81、3.91、0 μmol·L-1，依次進(jìn)樣，結(jié)合時間為80 s，流速為30 μL·min-1，解離時間為180 s；結(jié)果通過計算機(jī)擬合并進(jìn)行穩(wěn)態(tài)分析得到其親和力常數(shù)KD值。

2.8 結(jié)直腸癌類器官

2.8.1類器官培養(yǎng) 從冷凍保存的類器官庫中獲得CCOs，并將CCOs重懸于基質(zhì)膠與完全培養(yǎng)基(約2 ∶1)中，接種于48孔板中，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基為DMEM/F12添加R-spondin-1重組蛋白(500 μg·L-1)、Noggin 重組蛋白(100 μg·L-1)、EGF(50 μg·L-1)、HEPES緩沖液、谷氨酰胺添加劑、N2添加劑(1×)、N-乙酰半胱氨酸(1 mmol·L-1)、煙酰胺(10 mmol·L-1)、A83-01(500 nmol·L-1)、Y-27632(10 μmol·L-1)、SB202190(3 μmol·L-1)、B27添加劑(1×)；48 h更換1次培養(yǎng)基，10～14 d傳代1次。

2.8.2類器官活力測定 將CCOs接種于96孔板，當(dāng)類器官生長匯合度達(dá)50%時，分別給予不同濃度的L-OHP(0.64、3.2、16、80、400 μmol·L-1)和CEL(0.0562、0.2808、1.404、7.02、35.1 μmol·L-1)，DMSO作為空白對照組，給藥6 d后，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，并拍照記錄給藥后類器官形態(tài)特征變化。

3 結(jié)果

3.1 CEL對3種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用CEL給藥48 h后，CCK-8法檢測，利用Graphpad Prism8軟件計算CEL對3種腫瘤細(xì)胞半數(shù)抑制濃度為(A549:IC50=2.37±0.02 μmol L-1、HCT-116:IC50=1.40±0.21 μmol L-1、HepG2:IC50=2.52±0.02 μmol L-1)，見Fig 1。結(jié)果表明，CEL對3種腫瘤細(xì)胞系(A549、HCT-116、HepG2)均具有抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性，其中對HCT-116的抑制活性相對最好。

3.2 CEL 抑制HCT-116細(xì)胞的STAT3磷酸化及其下游蛋白(Survivin、MCL-1)而對其上游蛋白(JAK2、p-JAK2)無影響Western blot的結(jié)果顯示，與DMSO組相比，IL-6誘導(dǎo)后p-STAT3(A)、p-JAK2(B)、MCL-1(C)、Survivin(C)的表達(dá)明顯增加，經(jīng)過CEL處理后p-JAK2無明顯影響(P>0.05)，其余蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)下降趨勢，且隨著給藥濃度的增加而降低，差異均具有顯著性(P<0.05),見Fig 2。以上結(jié)果表明，CEL可能是靶向抑制STAT3的磷酸化，而不影響其上游蛋白的活性。

3.3 CEL 能夠誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期

3.3.1細(xì)胞凋亡 我們使用Annexin-V-FITC/PI雙重染色法進(jìn)行細(xì)胞分析，從Fig A1-A4看出與對照組相比隨著CEL濃度的增加，早期凋亡百分比率增加(1.78%～30.84%)，從Fig A5可知，早期凋亡的比率隨著CEL濃度的增加而增加，在CEL高濃度時晚期凋亡的比率明顯增大(P<0.01)，結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義；說明各組與DMSO組間均有差異。以上結(jié)果表明，CEL能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，見Fig 3。

3.3.2細(xì)胞周期 稀釋不同濃度的CEL干擾HCT-116細(xì)胞48 h，從Fig B1-B4可以看出于對照組相比，CEL組S期的細(xì)胞數(shù)目增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)目減少，表明CEL能阻滯細(xì)胞周期，見Fig 3。

Fig 1 Growth inhibition curve of CEL on A549,

Fig 2 CEL inhibited p-STAT3 and its downstream genes (Survivin and MCL-1) but not upstream gene JAk2 in HCT-116 n=3)

Fig 3 Apoptosis and cell cycle analysis of CEL on HCT-116 n=3)

3.4 CEL與人源STAT3重組蛋白具有明顯的親和力 利用表面等離子共振技術(shù)(SPR)測定小分子與蛋白間的親和力，CEL以不同濃度梯度依次進(jìn)樣。從Fig 4看出,響應(yīng)值(RU)與濃度成正比關(guān)系，通過計算機(jī)擬合結(jié)果，平衡解離常數(shù)KD值為6.038×10-5 mol·L-1，這表明CEL與STAT3蛋白的結(jié)合能力良好，為CEL可能是通過直接靶向抑制STAT3活性提供了更為直接的證據(jù)，以及本課題組同期發(fā)表文章[12]

3.5 分子對接CEL可以與rhSTAT3蛋白結(jié)合并抑制pTyr705位點的STAT3磷酸化，為了進(jìn)一步推測CEL的結(jié)合位點，采用了分子對接，如Fig 5所示，在CEL與STAT3蛋白的殘基LYS-591、ARG-609、GLU-612、SER-613、ILE-634、ARG-595之間形成了多個強(qiáng)氫鍵。同時，CEL可以與殘基TRP-564、ILE-589、PRO-639、VAL-637、SER-636、GLN-635、GLN-633、LYS-591產(chǎn)生疏水相互作用，表明CEL能夠緊密地與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而抑制STAT3的磷酸化，分子對接進(jìn)一步佐證了SPR結(jié)果，見Fig 5，以及本課題組同期發(fā)表文章[12]。

3.6 CEL可以抑制結(jié)直腸腫瘤類器官的生長為了進(jìn)一步驗證CEL對結(jié)直腸癌的抑制作用，建立了4例患者來源的CCOs(CCO-1、CCO-2、CCO-3、CCO-4)及1例CNO，利用CCK-8法檢測CEL對CCOs的抑制作用，繪制IC50曲線，結(jié)果顯示CEL的抑制作用強(qiáng)于陽性藥奧沙利鉑(L-OHP)，見Fig 6。

4 討論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是極其復(fù)雜的過程，IL-6受體介導(dǎo)的JAK2/STAT3信號通路主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖及分化，STAT3作為致癌基因能夠在腫瘤細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)[6]，尋找STAT3小分子抑制劑成為開發(fā)抗腫瘤候選藥物的潛在途徑[13]。本文通過體外實驗發(fā)現(xiàn)CEL對3種腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用，其中對HCT-116細(xì)胞活性最好。在最新文獻(xiàn)中，CEL通過靶向STAT3抑制AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞重塑[10]，為了驗證其作為STAT3抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用的推測，我們進(jìn)一步探討了CEL抗結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制。首先，蛋白免疫印跡的結(jié)果說明，CEL不僅能夠呈濃度依賴性下調(diào)STAT3的磷酸化，并且使其下游效應(yīng)蛋白(Survivin，MCL-1)的表達(dá)量顯著降低；但是不影響其上游蛋白JAK2的表達(dá)與磷酸化；其次，通過Annexin-V-FITC/PI雙重染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測凋亡與周期，發(fā)現(xiàn)CEL能夠增加細(xì)胞凋亡率，阻滯細(xì)胞合成期的發(fā)生。Survivin屬于細(xì)胞凋亡抑制劑(IAP)的蛋白質(zhì)家族成員，MCL-1是BCL-2蛋白家族的重要成員之一[14-15]，因此，以上結(jié)果說明，CEL有可能是通過靶向抑制STAT3，下調(diào)Survivin、MCL-1等下游通路來誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞的凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長與增殖。然后，我們通過SPR技術(shù)進(jìn)一步證實了CEL對STAT3蛋白的結(jié)合能力，分子對接推測CEL是通過與SH2結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合來抑制STAT3的磷酸化。最后，我們利用結(jié)直腸腫瘤類器官模型驗證了CEL的抗腫瘤作用。類器官模型是從病人體內(nèi)獲取癌細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)成的三維“微器官”，比二維細(xì)胞系更接近人類腫瘤，能夠復(fù)制一些癌癥特征，是細(xì)胞模型和動物模型所不能夠表現(xiàn)的，具有更好的真實性，類器官還具有構(gòu)建周期短，能夠保存供體異質(zhì)性等優(yōu)點[16-17]。

Fig 4 The binding kinetic curve of CEL and STAT3 protein

Fig 5 Molecular docking and binding analysis of CEL on STAT3 SH2 domain

綜上，CEL具有明顯的抗結(jié)直腸癌活性，其機(jī)制可能是通過靶向抑制STAT3發(fā)揮作用。然而，CEL因其水溶性差，治療窗窄、生物利用度低限制了其在治療癌癥的應(yīng)用，而且在本研究中CEL對正常結(jié)腸癌類器官也表現(xiàn)出一定的毒性，臨床轉(zhuǎn)化有一定的難度，因此本課題組針對CEL開展了一系列結(jié)構(gòu)修飾研究[12]，并篩選得到活性更強(qiáng)的酰胺化衍生物。另外Wagh等[18]總結(jié)到基于納米技術(shù)制劑傳遞藥物可能提高CEL整體藥理功效和安全性。在未來，各種策略的結(jié)合和利用，有望基于雷公藤紅素開發(fā)出新的候選抗癌藥物。