川芎嗪抗糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的轉錄組學研究

袁仕林，孫 苗，周玉佳，劉 瓊 ，常 青，黑常春，楊 笑，4

(寧夏醫科大學 1.臨床醫學院神經病學中心、2.基礎醫學院、3.生育力保持教育部重點實驗室、4.寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

腦卒中因其居高不下的發病率、致殘率及死亡率而給人類社會帶來沉重負擔。糖尿病(diabetes mellitus,DM)作為腦卒中的獨立危險因素不僅增加缺血性腦卒中的發病率，而且顯著加重缺血腦組織的損傷程度。然而DM加重腦缺血損傷的具體機制尚不十分明確，同時缺乏有效防治手段。

川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是從川芎根莖中提取的一種生物堿類化合物。許多體內外實驗與臨床證據表明其具有舒張血管、保護心肌細胞、抗肝纖維化、抗脊髓損傷等多種作用[1]。一項TMP治療缺血性腦卒中患者的Meta分析顯示[2]，TMP能夠改善缺血性腦卒中患者的神經功能缺損，且不良事件發生率低。Ding等[3]發現TMP通過激活PI3K/Akt通路對腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷大鼠起到神經保護作用。但目前，TMP對DM加重的腦I/R損傷是否有改善作用尚未見報道。

近些年，轉錄組學技術不斷發展，逐漸在基因挖掘、代謝調控、藥物研發、揭示疾病分子機制等方面發揮日益重要的作用。因此，本研究利用全長轉錄組測序技術，擬從整體角度探討TMP對DM大鼠腦I/R損傷的神經保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 寧夏醫科大學實驗動物中心提供8～10周齡SD雄性大鼠，體質量(220～280 g)，動物許可證號為SCXK(寧)2020-0001。實驗中所有操作均經過寧夏醫科大學實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會審核，批準號為ACUC-NYLAC-2019-109。

1.1.2藥品、試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美國Sigma公司，貨號S0130)；血糖測量儀、血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司，批號130911)；鹽酸川芎嗪注射液(河南輔仁懷慶堂制藥有限公司，批號20062311)；尼氏染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1430)；TUNEL試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號A112-02)；反轉錄、RT-qPCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，貨號分別為AU341-02、AQ601-02)；Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)抗體(沈陽萬類生物科技有限公司，貨號WLH4120)；磷酸化核因子-κB p65(phosphorylated-nuclear factor kappa-B p65,p-NF-κB p65)、核因子-κB p65(nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65)抗體(美國CST公司，貨號分別為3033、8242)；髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response 88,MyD88)抗體(英國Abcam公司，貨號ab2064)；白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)抗體(上海碧云天生物技術有限公司，貨號AF7209)；白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)抗體(北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-0782R)；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cleaved Caspase-3)抗體(英國Abcam公司，貨號ab214430)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(上海艾比瑪特醫藥科技有限公司，貨號分別是T40044、T40056)；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號10494-1-AP)。

1.1.3儀器 R5401E小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Leica RM 2235切片機(德國Leica公司)；Thermo Scientific Multiskan GO全波長酶標儀、Proflex 3×32型數字PCR 儀(美國Thermo Fisher公司)；OSE-DB-02制冷型程控五段金屬浴(北京天根生化科技有限公司)；PromethION48測序儀(英國Oxford Nanopore Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組 122只SD大鼠先分為正常血糖組(Control組)和糖尿病組(DM組)，將DM模型成功的大鼠隨機又分為DM對照組和川芎嗪(TMP)治療組。每個大組又分為假手術組(Sham)和腦缺血/再灌注組(I/R)。分組如下：正常血糖假手術組(NC組)、正常血糖腦缺血/再灌注組(NG組)、DM假手術組(DMC組)、DM腦缺血/再灌注模型組(DMG組)、DM假手術+TMP治療組(TMPC組)、DM腦缺血/再灌注模型+TMP治療組(TMP組)。舍棄DM模型不成功的大鼠12只及腦缺血/再灌注術中死亡的大鼠8只(DMG組6只，NG組2只)，余下102只動物納入研究，每組均為17只。

1.2.2建立DM模型與給藥 DM組大鼠在給藥前一晚禁食12 h，次日一次性快速腹腔注射STZ(50 mg·kg-1)誘導DM模型。3 d及1周后測量其血糖值，血糖值>16.7 mmol·L-1則認為DM模型建立成功。同時每間隔1周監測其血糖值。4周后進行腦缺血/再灌注處理。TMP治療組連續腹腔注射TMP 1周(40 mg·kg·d-1)后進行手術，其余組給予等量生理鹽水注射。

1.2.3建立全腦缺血/再灌注模型 大鼠經動物麻醉機異氟烷誘導麻醉，整個手術過程維持低濃度運行。按照課題組前期方法[4]建立全腦缺血/再灌注模型：雙血管閉塞法(2-VO,10 min)，再灌注16 h。實驗流程圖如下。

1.2.4腦含水量測定 大鼠在術后16 h水合氯醛麻醉下處死，迅速取出大腦，去除小腦、嗅球及腦干，用生理鹽水沖洗腦組織血液并用吸水紙吸干，將整個大腦放置于電子天平稱量紙上稱質量，此為濕質量，然后放置于100 ℃烘干箱內干燥24 h，再次稱取大腦質量，即為干質量，腦含水量/%=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.2.5HE染色 術后16 h，對動物進行腦組織灌注固定，取出大腦，4%多聚甲醛繼續固定24 h。常規脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。顯微鏡下觀察壞死細胞、拍照。壞死細胞排列紊亂，形態不規則，呈現三角形、菱形和不規則形，細胞質嗜酸性，核固縮、核膜不清楚、核仁不清。每組選用5張切片，每張切片選取皮質區的4個視野進行統計。結果表示為壞死細胞數除以總細胞數(%)。

Fig 1 Experimental flow chart

1.2.6尼氏染色 使用尼氏染色試劑盒進行腦片染色。將切片置于試劑盒焦油紫染色液中，并放置于42 ℃水浴鍋中1 h，95%乙醇分化后脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下拍照、觀察神經元、尼氏體。

1.2.7TUNEL染色 使用TUNEL試劑盒進行腦片染色。分別滴加50 μL蛋白酶K工作液、1×Equilibration Buffer、TdT孵育緩沖液、DAPI溶液，熒光顯微鏡下拍照。結果以TUNEI陽性細胞數/DAPI細胞總數的百分比來表示。

1.2.8轉錄組測序 取右側皮質，用TRIzol試劑盒提取RNA。使用mRNA capture beads從總RNA中純化出Poly(A) mRNA，利用反轉錄引物通過退火與mRNA的poly A尾結合，然后加入RT逆轉錄酶合成第一鏈，通過PCR擴增引物擴增成雙鏈 cDNA，使用NEBNext FFPE DNA Repair Mix和NEBNext Ultra Ⅱ End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復和末端修復加A，使用SQK-LSK109試劑盒完成測序接頭的連接，配置上機文庫，用PromethION48測序儀進行測序，每組設4個生物學重復。

1.2.9生物信息學分析 測序完成后，過濾原始數據，得到總的高質量的數據(Clean Data)以利于后續生信分析。把Fold Change≥1.5且P<0.05作為篩選標準，將篩選出的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)進行GO、KEGG分析。

1.2.10實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 提取大鼠腦組織RNA，反轉錄成cDNA，使用RT-qPCR試劑盒檢測各組關鍵基因TLR2、MyD88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、Caspase-3、Bcl-2的基因表達水平，反應程序為94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，55 ℃、15 s，72 ℃、10 s，45 個循環，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

1.2.11Western blot 提取大鼠腦組織蛋白，BCA法蛋白定量，以10 μL體系上樣，常規電泳，轉膜300 mA 1 h，快速封閉液封閉2 h。加入TLR2(1 ∶1 000)、MyD88(1 ∶500)、p-NF-κB p65(1 ∶1 000)、NF-κB p65(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1 ∶4 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)一抗、對應二抗孵育(1 ∶10 000)，曝光，用ImageJ分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖值統計結果NG組術前血糖為(5.52±0.73)mmol·L-1，STZ誘導的DMG組術前血糖為(26.59±3.62)mmol·L-1，TMP組術前血糖為(26.45±3.19)mmol·L-1，血糖值未見明顯變化(P>0.05)。

Tab 2 Statistical table of preoperative blood glucose

of rats in each

2.2 各組大鼠腦含水量統計結果與NC組比較，NG組腦含水量明顯增加(P<0.01)，DMG組腦含水量進一步增加(P<0.01)；與DMG組比較，TMP治療可明顯降低DM大鼠腦I/R后的腦含水量(P<0.01)，表明TMP可以減輕DM大鼠腦I/R后的腦水腫程度。

Tab 3 Comparison of brain water content among

GroupBrainwatercontent/%NC65.77±0.42NG81.13±0.23??DMC79.06±0.47##DMG83.27±0.30??##TMPC79.57+0.51TMP81.59±0.30??△△

2.3 TMP對DM大鼠腦I/R后細胞壞死的影響HE染色結果如Fig 2所示，NC組大鼠腦組織右側皮質神經元排列整齊，細胞形態完整，可見清晰核膜，染色均勻。NG組細胞間質水腫，核仁顯示不清，核固縮可見明顯壞死神經元，與NC組相比，壞死細胞明顯增多[(1.33±0.23)%vs(16±1)%，P<0.01]。DMG組較NG組神經元損傷進一步加重[(34±2.64)%vs(16±1)%，P<0.01]。TMP與DMG組相比，壞死細胞明顯降低[(17.33±1.52)%vs(34±2.64)%，P<0.01]。

Fig 2 HE staining and necrotic neurons statistical

A：HE staining of rat cortex.The arrow refers to necrotic neurons；B：Statistics of necrotic neurons.**P<0.01vsSham group；##P<0.01 DMvsControl group；△P<0.05,△△P<0.01 TMPvsDM group.

2.4 TMP對DM大鼠腦I/R后神經元及尼氏體的影響尼氏染色結果如Fig 3所示，NC組大鼠腦組織右側皮質神經元染色均一、排列整齊、結構完整，數目較多，尼氏體豐富。NG組可見神經元數目和尼氏體減少，DMG組神經元數目及尼氏體進一步減少，TMP組神經元數目有所恢復，尼氏體增多。

Fig 3 Nissl staining of rat

2.5 TMP對DM大鼠腦I/R后細胞凋亡的影響TUNEI染色結果如Fig 4，Sham組偶可見零星凋亡細胞，NG組凋亡細胞數量明顯增多(8.13±1.17)%(P<0.01)；DMG組較NG組明顯多(13.97±1.57)%(P<0.01)；而TMP組陽性細胞數量明顯減少(7.06±1)%(P<0.01)，表明TMP能夠減輕DM大鼠腦I/R后的神經元凋亡。

2.6 全長轉錄組數據分析

2.6.1測序數據產出統計 將原始fastq數據經過過濾后得到總的高質量的數據(Clean Data)，其信息統計見Tab 4。

Tab 4 Statistical table of Clean Data of each

Fig 4 TUNEL staining and TUNEL positive cell statistical

2.6.2差異表達基因分析 采用DESeq2軟件篩選DEGs(須滿足Fold Change≥1.5且P<0.05)。結果如Fig 5。與DMC組比較，DMG組篩選到的DEGs一共有3 289個，其中明顯上調的基因有2 489個，明顯下調的基因有800個；而給予TMP干預后，共出現1 125個DEGs，這其中包括上調基因473個，下調基因652個。

2.6.3差異表達基因GO富集分析 為了研究TMP抗DM大鼠腦I/R損傷的分子機制，進一步對

Fig 5 Volcano map of differentially expressed genes

這些DEGs進行GO富集分析(Fig 6)。與DMC組比較，DMG組的DEGs主要富集于細胞質(cytoplasm)，中性粒細胞趨化性(neutrophil chemotaxis)，趨化因子活性(chemokine activity)，參與細胞凋亡執行階段的半胱氨酸型內肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in execution phase of apoptosis)等條目上。與DMG組比較，TMP治療組的DEGs主要富集于炎癥反應(inflammatory response)，轉錄因子復合物(transcription factor complex)，生長因子活性(growth factor activity)等生物學功能。

2.6.4差異表達基因KEGG注釋分類及通路富集分析 利用KEGG數據庫對DEGs進行功能注釋分類、通路富集。與DMC組比較，DMG組DEGs主要注釋及富集在MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)，細胞凋亡(apoptosis)，NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)，p53信號通路(p53 signaling pathway)，瞬時受體電位通道的炎癥介質調節(inflammatory mediator regulation of TRP channels)等。

Fig 6 GO enrichment map of differentially expressed genes

Tab 5 KEGG pathway and up-regulated genes of DMC vs DMG

Tab 6 KEGG pathway and down-regulated genes of DMG vs TMP

與DMG組相比較，給予TMP治療后顯示出的DEGs主要注釋及富集在細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)，MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)，Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)，白細胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)，細胞凋亡-多物種(apoptosis -multiple species)。

Fig 7 KEGG annotation classification and pathway enrichment map of differentially expressed genes

2.6.5小結 GO富集分析顯示，DM腦I/R后DEGs主要富集于中性粒細胞趨化性、趨化因子活性、參與細胞凋亡執行階段的半胱氨酸型內肽酶活性等條目上；KEGG通路注釋及富集分析顯示DEGs主要富集于MAPK、NF-κB、p53等炎癥、凋亡相關信號通路，其中主要上調的基因有TLR2、MyD88、NF-κB、IL-1β、Caspase-3、CXCL1、CCL2、ICAM1等。提示我們，DM腦I/R后趨化因子、細胞間黏附分子1、炎癥因子等炎癥相關基因及凋亡基因表達上調。而在TMP治療組，GO富集分析顯示DEGs主要富集于炎癥反應、轉錄因子復合物等條目上；KEGG通路注釋及富集分析顯示DEGs主要富集于Toll樣受體、MAPK、IL-17、細胞凋亡-多物種等炎癥、凋亡相關信號通路。其中主要下調的基因有TLR2、MyD88、IL-1β、Caspase-3、CXCL12、CCL27等基因。提示TMP治療可以下調炎癥相關的基因與凋亡基因的表達。以上結果提示，我們TMP抗DM腦I/R損傷的機制可能與其減輕炎癥反應、細胞凋亡相關。因此我們對部分凋亡與炎癥相關的基因進行了實驗驗證。

2.7 TMP對DM大鼠腦I/R損傷凋亡相關基因mRNA、蛋白表達的影響結果顯示，與NC組比較，NG組Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯上調，Bcl-2 mRNA、蛋白表達明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.05)。與NG組相比，DMG組Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯升高，Bcl-2明顯降低(P<0.05)。而TMP治療后Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯降低，Bcl-2明顯升高(P<0.05)。

2.8 TMP對DM大鼠腦I/R損傷炎癥相關基因mRNA、蛋白表達的影響結果顯示，與NC組比較，NG組TLR2、MyD88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達明顯上調，差異均具有統計學意義(P<0.05)。與NG組相比，DMG組TLR2、MyD88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達進一步上調(P<0.01)。而TMP治療后明顯逆轉上述基因mRNA、蛋白表達的上調(P<0.01)。

Fig 8 Detection of mRNA and protein expression

A：RT-qPCR to detect the expression of Caspase-3,Bcl-2 mRNA in rats；B：Western blot to detect the expression of Cleaved caspase-3,Bcl-2 protein in rats.*P<0.05,**P<0.01vsSham group；#P<0.05,##P<0.01 DMvsControl group；△P<0.05,△△P<0.01 TMPvsDM group..

3 討論

多項研究報道，中藥川芎提取物TMP能夠改善腦I/R損傷[5-6]。本研究發現，在經歷腦缺血后，DM組大鼠較正常血糖組大鼠神經損傷明顯加重，表現在腦水腫增加，神經元、尼氏體數目減少，細胞壞死率、凋亡率增高，而TMP治療可減輕其腦水腫程度，增加神經元、尼氏體數目，并且顯著減少細胞壞死和凋亡，顯示出良好的抗DM腦缺血作用。

細胞凋亡是一種相對有序的能量依賴性的程序性細胞死亡過程。細胞凋亡的激活一般有內在和外在兩種途徑。無論哪種途徑，最終都會激活凋亡反應最為關鍵的執行者Caspase-3[7-8]。Zhong等[9]的研究表明，TMP通過抑制JNK/MARK信號通路介導的細胞凋亡保護海馬神經元免受缺氧/復氧損傷。本研究中，DM大鼠腦I/R后及TMP治療后DEGs亦主要富集于細胞凋亡相關的生物學過程與信號通路。如DM大鼠腦I/R皮層Caspase-3表達上調，而TMP治療后其表達下調。RT-qPCR與Western blot驗證結果同樣顯示：DM大鼠腦I/R后皮層Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯增強，Bcl-2 mRNA及蛋白表達明顯減弱；TMP治療后Caspase-3 mRNA及蛋白表達明顯減弱，Bcl-2 mRNA及蛋白表達明顯增強，與轉錄組測序結果基本一致。結合TUNEL染色結果，我們認為DM通過加重大鼠腦I/R后的細胞凋亡加重了缺血腦組織的損傷，而TMP可能通過抑制凋亡減輕了DM大鼠腦I/R后的病理損傷。

炎癥級聯反應在腦I/R損傷機制中占據關鍵地位。此外，全身和腦血管炎癥增加是DM及其血管并發癥主要的病理生理特征之一[10]。DM合并腦缺血時，腦組織受到高血糖與缺血缺氧雙重因素影響，其炎癥反應可能會大大加重。過量的炎癥反應會引發神經細胞凋亡，形成惡性循環，加劇組織損傷。本研究中，GO富集分析顯示DM大鼠腦I/R后及TMP治療后DEGs主要富集于炎癥反應等條目上。

Fig 9 Detection of mRNA and protein expression of inflammation-related genes in rats by RT-qPCR and Western

KEGG分析提示，DM腦I/R后IL-1β基因上調，TMP治療后IL-1β基因下調，進一步做RT-qPCR與WB結果顯示DM大鼠腦I/R后大腦皮質IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達較正常血糖大鼠腦I/R明顯增強，而TMP治療后，IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達明顯減弱。提示我們DM可能通過加重炎癥反應加重腦I/R損傷，TMP治療減輕了DM加重的腦I/R損傷的炎性反應。

DM能夠通過誘導慢性炎癥促進動脈粥樣硬化斑塊形成從而加重卒中風險，其發生的關鍵機制包括依賴NF-κB的促炎細胞因子產生、Toll樣受體(toll like receptors,TLRs)的表達、氧化應激的增加和炎癥小體的激活[10-11]。TLRs是一個在先天免疫系統中扮演重要角色的分子家族。在TLRs家族中，TLR2與TLR4在腦I/R損傷炎癥反應中占據主要地位。細胞外信號主要通過依賴MyD88和不依賴MyD88的途徑傳遞到下游模塊。而TLR2主要通過依賴MyD88的途徑傳遞信號。MyD88可激活白細胞介素-1受體相關激酶4、白細胞介素-1受體相關激酶1從而進一步刺激下游NF-κB信號通路的激活[12]。激活后的NF-κB通路促進大量促炎基因表達，如IL-1β、IL-6、趨化因子等從而加重腦缺血后的炎癥反應。實驗發現，丹酚酸A通過抑制TLR2的激活減輕急性腦I/R時小膠質細胞介導的炎癥反應[13]。此外，研究報道TMP可以通過減輕炎癥反應改善腦I/R損傷[14]。本研究中，GO與KEGG分析顯示TMP治療后，DEGs主要富集于Toll樣受體、IL-17等炎癥相關生物學過程與信號通路上，且TMP下調了TLR2、MyD88的表達。RT-qPCR與WB驗證結果顯示，TMP治療明顯降低了DM大鼠腦I/R后大腦皮質TLR2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白的高表達，進一步證實了TMP對DM大鼠腦I/R損傷的抗炎作用，其機制可能是通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號通路來實現的。

綜上所述，本研究發現TMP可以有效減輕DM腦I/R損傷，其機制可能與抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號通路減輕炎癥反應、細胞凋亡相關。以上結果為DM加重腦I/R損傷的機制研究提供了依據，也為運用轉錄組學及蛋白質組學、代謝組學等組學技術深入、深化中醫藥藥理機制提供了思路。