斜率比法測定水蛭抗凝血活性的實驗室間聯合驗證方法學

胡宇馳，肖斯婷，楊文良，郭玉東，許華玉，高 華，張 媛，唐黎明，張素慧，樸晉華，王婷婷，張 蕻，芮 菁，華曉東，侯 娟，楊天驕，李 波

(1.北京市藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局創新藥物安全研究與評價重點實驗室，中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206；2.國家藥典委員會，北京 100061；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；4.上海市食品藥品檢驗研究院，上海 200233；5.山西省食品藥品檢驗所，太原 030001；6.天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

水蛭是典型的活血化瘀藥物，收載入《中國藥典》，其功能主治為破血通經、逐瘀消癥[1]。已有的研究結果證明，水蛭的藥理作用有抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、改善血液流變學、促進纖溶等，抗凝血是其主要的作用[2]。部分凝血活酶時間(APTT)的縮短是很多疾病的典型指標，尤其是血瘀證相關疾病，血液呈現高凝狀態的血栓性疾病，如心肌梗塞、腦血管病變、肺梗死、深靜脈血栓形成、妊娠高血壓綜合癥和腎病綜合癥等[3]。已有的研究結果證實，水蛭具有縮短APTT的作用，整體動物試驗和離體試驗具有規律的一致性[4]。

本課題組經過研究證實，離體兔血漿中加入水蛭浸提液，浸提液濃度與APTT值的對數呈現直線關系，符合斜率比法測定的統計模型的要求，幾批藥材的預測定表明方法可行，初步證明斜率比法是適宜的測定水蛭抗凝血活性的生物檢定方法[5]。本文為進一步的方法學驗證研究。通過多家實驗室測定，進一步證明方法的科學性、適宜性和可行性，總結實驗中的注意事項，并比較斜率比法和《中國藥典》2020年版中收載的凝血酶滴定法的差異。

1 材料與方法

1.1 參加聯合驗證的實驗室在國家藥典委員會的組織下，由北京市藥品檢驗研究院經前期研究后提出標準操作規程，統一提供藥品，北京市藥品檢驗研究院、中國食品藥品檢定研究院、天津市藥品檢驗研究院、山西省食品藥品檢驗所和上海市食品藥品檢驗研究院共5家實驗室按統一的規程進行驗證試驗。各單位將試驗原始記錄、數據計算和試驗報告進行整理，復印件統一提交，數據統一進行計算。

1.2 驗證用藥品螞蟥飲片，由北京康而福藥業有限公司提供3批，批號分別為：20171201、20171202、20171203。采用冰凍粉碎機粉碎成100目碎末。日本醫蛭藥材，由貴州信邦制藥股份有限公司提供4批，批號分別為：20171001、20171002、20170902、20170901，已由提供單位凍干粉碎。脈血康膠囊9批，由生產企業提供或由市場購置。螞蟥對照藥材，批號：121061-201806，購自中國食品藥品檢定研究院。菲牛蛭對照藥材，批號：121754-201901，購自中國食品藥品檢定研究院。協作驗證用由北京市藥品檢驗研究院統一提供給5家實驗室。

1.3 儀器和APTT試劑全自動血液凝固分析儀，包括ACLELTTE PRO和ACLELTTE 700等型號，Instrumentation Laboratory Company等單位生產，APTT試劑，由Instrumentation Laboratory Co等儀器實驗公司生產，批號：N0394780等。枸櫞酸鈉，購自北京化學試劑公司等。凝血酶、纖維蛋白原等，血凝儀及APTT測定試劑等，均由參與單位使用本單位的儀器設備和試劑。

1.4 動物及血漿日本大耳白家兔，5家實驗室各自使用自己實驗室的動物。家兔頸總動脈取血，3.2%枸櫞酸鈉1 ∶9抗凝，2 500 r·min-1離心15 min制備血漿，將多只(3只以上)兔血漿混勻，備用。

1.5 浸提液制備取水蛭對照藥材，精密稱定，加入0.9%氯化鈉注射液(1 g ∶10 mL比例)，混勻，4 ℃浸提30 min，低溫高速離心(4 ℃，5 000 r·min-1)制備上清液。吸取上清液，用0.9%的氯化鈉注射液稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液(加0點，4個濃度成等差數列)，適當時候可稀釋成其他適宜的等差系列濃度溶液(如7、14、2或10、20、30 g·L-1)。水蛭藥材脈血康膠囊，精密稱取藥材粉末或膠囊內容物，與對照藥材同法制備相同濃度的浸提溶液。

1.6 APTT測定與活性計算取活化部分凝血活酶時間(APTT)測定樣品杯若干，每管依次加入一種濃度的標準品或供試品溶液20 μL(空白對照為0.9%氯化鈉溶液)，兔血漿50 μL，APTT試劑50 μL，混勻，應避免產生氣泡，37 ℃±0.5 ℃預溫180 s，每管再加入CaCl2試劑50 μL，然后立即用血液凝固分析儀測定凝結時間，即APTT值。標準品或供試品稀釋液每個濃度的測定次數不得少于2次，各濃度的測定次數應相同。測定時，血漿、標準品或供試品稀釋溶液、APTT試劑、CaCl2試劑的預溫時間可根據儀器或試劑的說明書適當調整，或加樣后按儀器使用說明書進行測定。測定順序應保證標準品和供試品的平行性，盡量保證相同濃度的標準品和供試品稀釋液的測定時間接近。測定中建議使用空白、S1、S2、S3、T1、T2、T3，空白、T1、T2、T3、S1、S2、S3的順序進行測定。將測得的APTT值換算成對數，照斜率比法計算方法計算供試品抗凝血活性及實驗誤差。試驗的可靠性判定應成立，本法的可信限率(FL%)不得大于15%。

1.7 相對準確度、精密度、線性范圍研究取螞蟥對照藥材和菲牛蛭對照藥材，分別稱取0.64、0.8、1.0、1.25、1.56 g，加入10 mL氯化鈉注射液制備浸提液，均按估計效價100%與對照藥材，按照斜率比法測定水蛭抗凝血活性標準草案進行試驗。即5個待測溶液的相對效價水平分別為64%、80%、100%、125%和156%，在對數尺度上呈均勻間隔。每個效價水平由4家不同的實驗室進行相對效價測定，每家實驗室獨立得到2個測定值，共8個測定值按《中國藥典》2020年版附錄通則9401“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則”進行統計計算。

相對準確度可接受標準：每個效價水平相對效價測定值的相對偏差應在±20%范圍內；以效價理論值的對數(橫坐標)對其相應的效價測定值的對數(縱坐標)作直線回歸，回歸方程的斜率應在0.80～1.25范圍內。中間精密度可接受標準：每個效價水平相對效價測定值的幾何變異系數(GCV，%)應不大于20%。

線性范圍：相對準確度、中間精密度符合要求時的效價水平范圍，質量標準中可能出現效價的范圍應該在線性范圍內。

1.8 樣品測定驗證采用螞蟥對照藥材，對3批螞蟥飲片在5家實驗室進行單獨測定，計算不同實驗室測定結果的精密度。采用菲牛蛭對照藥材，對4批日本醫蛭飲片在5家實驗室進行單獨測定，計算不同實驗室測定結果的精密度。采用菲牛蛭對照藥材，對9批脈血康膠囊在5家實驗室進行單獨測定，計算不同實驗室測定結果的精密度。采用《中國藥典》2020年版中收載的凝血酶滴定法，各家實驗室對3批螞蟥飲片、4批日本醫蛭飲片、9批脈血康膠囊、螞蟥對照藥材和菲牛蛭對照藥材進行抗凝血酶效價測定。樣品測定結果，統計5家實驗室的平均值和標準偏差，計算RSD%。

2 結果

2.1 實驗室對照藥材測定抗凝血活性結果依照驗證方案，由4家參加協作驗證的單位，分別采用組織單位準備的同一批螞蟥對照藥材和菲牛蛭對照藥材，在相對效價水平分別為64%、80%、100%、125%和156%，每家單位各測定兩個數據，要求是不同人員、不同儀器或不同日期。收到協作驗證的各單位數據后，將螞蟥對照藥材和菲牛蛭對照藥材的8個數據列表，見Tab 1、2，并將測定值按《中國藥典》2020年版附錄通則9401“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則”進行統計計算。各家實驗室的典型數據統計示意圖見Fig 1～4。

2.2 相對準確度計算5個效價水平相對效價測定值的相對偏差及其置信區間，見Tab 3、4。

Fig 1 Typical data diagram of slope ratio method for

Fig 2 Typical data of slope ratio method for collaborative

Fig 3 Typical data of slope ratio method for collaborative

Tab 1 Slope ratio method of leeches anticoagulant activity titer determination combined verification test results

Tab 2 Results of slope ratio method and verification of anticoagulant activity titer of phanthrene leeches

Tab 3 Relative deviation of anticoagulant activity of leeches control herbs with different titer levels

Tab 4 Relative deviation of anticoagulant activity of phenanthrene leeches with different titer levels

螞蟥對照藥材測定相對偏差均在±20%范圍內，以效價理論值的對數(橫坐標)對其相應的效價測定值的對數(縱坐標)作直線回歸，回歸方程為Y=0.986 1X+0.001 9，R2=0.959 1。斜率0.986 1在0.8～1.25,見Fig 5。

Fig 5 Logarithmic linear regression diagram of theoretical value and measured value of anticoagulant activity of leeches by slope ratio method

菲牛蛭對照藥材測定相對偏差均在±20%范圍內，以效價理論值的對數(橫坐標)對其相應的效價測定值的對數(縱坐標)作直線回歸，回歸方程為Y=0.980 9X-0.014 2，R2=0.964。斜率0.980 9在0.8～1.25，見Fig 6。

Fig 6 Logarithm linear regression diagram of theoretical and measured anticoagulant activity titer of phenanthrene leeches by slope ratio method

2.3 中間精密度按中間精密度評價方法項下計算公式計算每個效價水平相對效價測定值的幾何標準偏差、GCV及其置信上限，見Tab 5、6。

Tab 5 Calculation results of intermediate precision of

Tab 6 Calculation results of intermediate precision

螞蟥對照藥材的GCV均<20%。菲牛蛭對照藥材的GCV均<20%。說明在不同人員、不同儀器、不同日期、不同血漿等，多家實驗室測定的中間精密度均符合要求。

2.4 線性范圍以效價理論值的對數(橫坐標)對其相應的效價測定值的對數(縱坐標)作圖，采用最小二乘法進行線性回歸，見Fig 5、6。

螞蟥對照藥材擬合的直線回歸方程為Y=0.986 1X+0.001 9，相關系數為0.979 3。表明在64%～156%，都能夠進行準確測定，線性范圍符合要求。

菲牛蛭對照藥材擬合的直線回歸方程為Y=0.980 9X-0.014 2，相關系數為0.981 8。表明在64%～156%，都能夠進行準確測定，線性范圍符合要求。

2.5 樣品測定結果采用螞蟥對照藥材，對3批螞蟥飲片在5家實驗室進行斜率比法測定抗凝血活性，測定結果見Tab 7，同時采用《中國藥典》中收載凝血酶滴定法測定活性，結果見Tab 8。從測定結果可以看出，3批螞蟥飲片相對于螞蟥對照藥材來說，活性為99.5%、94.7%和100.4%，說明抗凝血效果與螞蟥對照藥材基本相似。進行重復測定，3批螞蟥飲片的RSD%分別為13.9%、15.6%和9.9%，均<20%，說明樣品測定在多家實驗室接測定結果基本一致，重復性較好。

采用菲牛蛭對照藥材，對4批日本醫蛭飲片在不同天進行重復測定，測定結果見Tab 9，同時采用《中國藥典》中收載凝血酶滴定法測定活性，結果見Tab 10。從測定結果可以看出，4批日本醫蛭飲片相對于菲牛蛭對照藥材來說，抗凝血活性在79.4%、80.6%、127.8%和135.2%，4批日本醫蛭的抗凝血活性差異較大。不同實驗室之間，測定結果的RSD%分別為15.4%、9.4%、13.5%和12.5%，均<20%，說明不同實驗室之間對同一樣品測定重復性較好。凝血酶滴定法測定日本醫蛭飲片，測定結果均>16.0 U·g-1符合《中國藥典》的規定。但凝血酶滴定法多家實驗室測定結果之間差異較大，包括對照藥材和飲片，RSD%均>50%，最高達78%；從測定結果一致性來看，斜率比法是優于凝血酶滴定法的。

選擇菲牛蛭對照藥材為標準品，采用斜率比法測定9批脈血康膠囊的抗凝血活性，結果見Tab 11。同時采用《中國藥典》中收載凝血酶滴定法測定活性，見Tab 12。

從測定結果可以看出，9批脈血康膠囊相對于菲牛蛭對照藥材來說，抗凝血活性在14%～36%，試驗均成立，5家實驗室測定結果RSD%均<20%，斜率比法測定抗凝血活性適用于脈血康膠囊。凝血酶滴定法測定9批脈血康膠囊，多家實驗室測定結果之間差異較大，RSD%均>50%，最高達68%；從測定結果一致性來看，斜率比法是優于凝血酶滴定法的。

3 討論

中藥生物活性質量控制的關鍵是實驗誤差的控制，需要在多家實驗室進行方法的重現并得到基本一致的測定結果，這是目前中藥生物活性測定研究的難點，也是方法建立過程中必須進行的一個步驟[6-7]。《中國藥典》2020年版的通則9105“中藥生物活性測定指導原則”中，對實驗室間的方法學驗證僅有原則性規定，未見實操性的詳細內容。本文考慮到斜率比法測定水蛭抗凝血活性是量化測定、采用樣品和對照品比較的方法，因而參照通則9401“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則”來制定驗證方案，為中藥生物活性測定方法的實驗室間聯合驗證提供一個可供參考的實例[8-12]。

Tab 7 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of leeches prepared slices

Tab 8 Results of thrombin titration for determination of the activity of leeches decoction pieces combined with verification

Tab 9 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of Japanese medical leeches decoction pieces

Tab 10 Results of thrombin titration for determination of activity of Japanese medical leeches decoction pieces combined with verification

Tab 11 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of Maixuekang capsules

Tab 12 Activity of Maixuekang capsules determined by thrombin titration

(1)方法的準確度。采用螞蟥和菲牛蛭對照藥材，設置5個相對水平值64%、80%、100%、125%、156%，4家實驗室測定的相對偏差均<±20%，效價理論值對數(橫坐標)和對應的效價測定值對數(縱坐標)呈現明顯的直線關系，相關系數>0.95，斜率在0.95～1.05，說明方法的準確度較好。

(2)中間精密度。采用對照藥材經5家實驗室間方法學考察，不同人員、不同儀器、不同日期、不同血漿等，各效價水平的GCV均≤20%，說明方法的中間精密度符合要求。采用多批次的飲片和脈血康制劑，多家實驗室之間的RSD%均<20%，也說明本法的精密度較好。5家實驗室之間，不同的儀器、人員、試劑等，測定藥材和制劑，結果均較為一致，證明了斜率比法測定水蛭抗凝血活性的方法的結果是可以重現性。

(3)線性范圍。從本次驗證的結果來看，當測定樣品的活性在對照品的64%～156%時，均可認為所測得的結果真實、可信；如果樣品的活性測定低于對照品的64%或高于156%時，應重新估計樣品的活性再次測定。

(4)方法之間的比較。凝血酶滴定法因滴定終點肉眼判定，未設對照消除誤差，測定值是離散型函數，導致結果的相對誤差大。與之相比，斜率比法是儀器自動判定結果、對照藥材消除誤差、結果是連續型函數，客觀性和準確性都更好，是一種更加科學的方法。

(5)方法的適宜性。經5家實驗室驗證，斜率比法適用于螞蟥、日本醫蛭等不同基源的藥材測定，也適用于脈血康制劑的測定，具有很好的推廣性。

綜上，斜率比法測定水蛭的抗凝血活性，方法準確、精密、穩定，符合方法學驗證的要求，可作為潛在的藥典方法，用于水蛭藥材和相關制劑的質量控制。